Sistemi e componenti immunitari

In questo video, dimostriamo l'isolamento dei monociti dal sangue umano intero mediante separazione immunomagnetica negativa. I monociti isolati possono essere utilizzati per ulteriori analisi a valle.

In questo video, dimostriamo l'isolamento delle cellule di Kupffer o dei macrofagi epatici dal fegato del topo. Il fegato viene perfuso con una soluzione digestiva seguita da separazione in gradiente di densità. Le cellule di Kupffer aderenti isolate possono essere utilizzate per ulteriori analisi.

Questo video dimostra un protocollo privo di enzimi per isolare i macrofagi dal ganglio della radice dorsale di topo (DRG) utilizzando una tecnica di dissociazione meccanica. Dopo l'omogeneizzazione del tessuto DRG appena raccolto, vengono utilizzati anticorpi contro i recettori della superficie cellulare sui macrofagi per marcare le cellule in modo fluorescente, seguito dall'esecuzione della citometria a flusso per confermare la presenza di macrofagi nel campione.

In questo video, dimostriamo l'isolamento dei linfociti da un cerotto di Peyer di topo raccolto. I linfociti isolati possono essere utilizzati per ulteriori analisi.

In questo video, dimostriamo l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico, PBMC, contenenti monociti e linfociti da un buffy coat umano mediante centrifugazione a gradiente di densità. Le PBMC isolate possono essere utilizzate per ulteriori analisi.

In questo video, dimostriamo l'isolamento delle cellule B dal sangue periferico umano utilizzando anticorpi biotinilati specifici per le cellule non B e microsfere magnetiche coniugate con streptavidina.

In questo video, dimostriamo l'isolamento e la coltura delle cellule stromali del midollo osseo dalle ossa lunghe dei topi. Le BMSC aderenti isolate possono essere utilizzate per ulteriori analisi.

Questo video dimostra l'isolamento delle cellule T dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) utilizzando la tecnologia di selezione cellulare attivata da galleggiabilità funzionalizzata (BACS). La tecnica di isolamento prevede la selezione positiva delle cellule T CD3+ mediante marcatura delle cellule con anticorpi anti-CD3 biotinilati e separazione delle cellule legate agli anticorpi utilizzando microbolle legate alla streptavidina.

In questo video, descriviamo un protocollo per l'attivazione delle cellule T primarie umane. L'incubazione di cellule T naive con biglie magnetiche rivestite con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28, seguita da un trattamento con interleuchina-2 o interleuchina-15, porta all'attivazione di cellule T naive e alla loro differenziazione e proliferazione in cellule T effettrici o di memoria.

In questo video, dimostriamo l'isolamento dei leucociti epatici marginanti dal fegato di topo mediante perfusione forzata.

Questo video dimostra l'isolamento dei linfociti, comprese le cellule natural killer o cellule NK, dal tessuto epatico umano per un'espansione selettiva. La digestione enzimatica e meccanica, seguita dalla separazione in gradiente di densità, favorisce l'isolamento dei linfociti, comprese le cellule NK. I linfociti raccolti possono essere ulteriormente utilizzati per l'espansione selettiva delle cellule NK.

Questo video mostra una tecnica per l'espansione di cellule natural killer (NK) direttamente dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) utilizzando una linea cellulare alimentatrice. Le PBMC sono co-coltivate con cellule alimentatrici linfoblastoidi geneticamente modificate che esprimono l'interleuchina-21 legata alla membrana (mIL-21) e la coltura è integrata con le citochine interleuchina-2 (IL-2) e interleuchina-15 (IL-15). Insieme, questo cocktail di ligandi porta...

Questo video dimostra la procedura di isolamento delle cellule di Sertoli dai tubuli seminiferi di topo, un componente dei testicoli. La digestione enzimatica e i lavaggi ripetuti favoriscono il rilascio di cellule di Sertoli nella soluzione, che possono essere ulteriormente coltivate per la proliferazione e la crescita.

Questo video dimostra un protocollo per l'isolamento basato sulla marcatura magnetica di una popolazione a bassa concentrazione di cellule T CD4+Vδ1+γδ da cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC). Utilizzando una combinazione di anticorpi anti-Vδ1 coniugati con FITC, microsfere magnetiche anti-FITC e perline superparamagnetiche rivestite con anticorpi anti-CD4, le cellule T CD4+Vδ1+ possono essere purificate con successo dalla popolazione PBMC.

In questo video, dimostriamo l'isolamento di neutrofili citotossici ad alta densità e neutrofili a bassa densità dal sangue di un topo portatore di tumore mediante centrifugazione discontinua in gradiente di saccarosio.

Questo video mostra la procedura di isolamento della rete di cellule immunitarie gengivali da un modello murino. La digestione enzimatica rilascia il tessuto gengivale dai denti e dall'osso attaccati, che viene ulteriormente digerito meccanicamente, liberando le cellule immunitarie dalla gengiva. Le cellule isolate sono pronte per esperimenti immunologici.

Questo video mostra un metodo di lavaggio peritoneale per isolare mastociti maturi di tipo tessuto connettivo dalla cavità peritoneale di topi adulti. Dopo aver isolato una miscela di cellule immunitarie primarie dalla cavità peritoneale, la proliferazione selettiva dei mastociti viene eseguita in condizioni di coltura appropriate.

In questo video, descriviamo un protocollo per isolare le cellule CD11b, inclusa la microglia, da cervelli di cuccioli di topo utilizzando lo smistamento cellulare attivato magneticamente. I tessuti cerebrali vengono omogeneizzati per ottenere sospensioni a singola cellula, che vengono incubate con microsfere rivestite di anticorpi anti-CD11b, seguite da una separazione basata su colonna magnetica per purificare la popolazione cellulare CD11b+.

Questo video mostra la procedura chirurgica di isolamento del linfonodo drenante inguinale da un modello murino. L'incisione della regione addominale fornisce l'accesso al linfonodo inguinale, che viene prelevato chirurgicamente. Il linfonodo inguinale traslucido raccolto può essere utilizzato per studi immunologici.

Questo video dimostra una tecnica di dissezione per raccogliere linfonodi drenanti poplitei dalle zampe posteriori del topo. I linfonodi svolgono un ruolo fondamentale nel collegare l'immunità innata e adattativa e la raccolta di linfonodi intatti, con una struttura tissutale e una vitalità cellulare preservate, può aiutare a studiare le risposte immunitarie locali e sistemiche.

Questo video dimostra l'innesco dei monociti primari nei macrofagi. I monociti umani primari possono essere isolati e differenziati in un fenotipo pro-infiammatorio M1-simile utilizzando il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) o in un fenotipo antinfiammatorio M2-simile utilizzando il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF).

Questo video descrive un metodo in vitro per generare macrofagi da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC). La generazione di macrofagi da iPSCs avviene in tre fasi: (i) aggregazione di iPSCs in sospensione per formare corpi embrioidi tridimensionali (EB) che si differenziano in cellule mesodermiche, (ii) formazione di cellule precursori dei macrofagi dalle EB differenziate e (iii) differenziazione delle cellule precursori dei macrofagi in macrofagi maturi e funzionali.

In questo video, dimostriamo una procedura per indurre la differenziazione e la polarizzazione di monociti derivati dal sangue periferico in macrofagi M1 o M2. L'incubazione con fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi, lipopolisaccaride e interferone-gamma produce macrofagi M1 pro-infiammatori, mentre l'incubazione con fattore stimolante le colonie di macrofagi e interleuchina-4 induce la produzione di macrofagi M2 antinfiammatori.

Questo video mostra un test in vitro per generare cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC) da cellule progenitrici linfoidi comuni (CLP). Dopo la co-coltura di CLP purificati con cellule feeder irradiate con γ in presenza del ligando tirosin-chinasi-3 (FL) Fms-like, i CLP si differenziano in pDC non aderenti, la cui presenza è confermata mediante citometria a flusso.

Questo video dimostra la generazione di cellule dendritiche immature, mature e tollerogeniche, o DC, da monociti umani. L'incubazione di monociti con fattori di crescita e citochine porta alla produzione di DC immature. In risposta alle molecole regolatorie immunitarie, le DC immature si differenziano in DC tollerogeniche e mature.

Questo video dimostra la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo (BMSC) in adipociti. Nel processo in due fasi, in presenza di specifici fattori di crescita e ormoni, le BMSC indifferenziate si differenziano prima in preadipociti. La seconda fase, che prevede il trattamento con glucosio e insulina, porta alla formazione di adipociti maturi con più goccioline lipidiche.

Questo video dimostra una tecnica per la differenziazione dei megacariociti e la formazione delle piastrine. Le cellule progenitrici staminali ematopoietiche, isolate dal sangue del cordone ombelicale umano, si differenziano in megacariociti maturi in presenza di trombopoietina. I megacariociti maturi producono estensioni citoplasmatiche chiamate propiastrine, che danno origine a singole piastrine.

Questo video mostra un protocollo per la generazione di cellule T funzionali antigene-specifiche da cellule T immature derivate da iPSC utilizzando un sistema di coltura timica tridimensionale. La co-coltura delle cellule T immature derivate da iPSC con lobi timici fetali di topi endogeni depleti di linfociti ha portato alla maturazione delle cellule T per formare emigranti timici derivati da iPSC CD8αβ+ MHC di classe I+ iPSC.

In questo video, descriviamo un protocollo per purificare le piastrine dal sangue intero murino e la loro successiva attivazione con l'agonista piastrinico trombina. Quando analizzate con citometria a flusso, le piastrine a riposo purificate sono caratterizzate in base all'espressione del loro marcatore di superficie cellulare CD41, mentre le piastrine attivate purificate co-esprimono entrambi i marcatori di superficie CD41 e CD62P.

Questo video dimostra una tecnica in vitro per generare e isolare trappole extracellulari (NET) di neutrofili. I neutrofili vengono isolati dal sangue periferico e stimolati con forbolo miristato acetato (PMA) per produrre NET. Durante l'incubazione, i neutrofili subiscono un processo di morte cellulare (NETosi) per rilasciare NET che comprendono cromatina decondensata mescolata con proteine citoplasmatiche granulari.

Questo video dimostra la differenziazione in vitro del fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi o delle cellule T helper produttrici di GM-CSF (THGM). Le cellule T naïve isolate sono stimolate per la differenziazione in THGM, che è confermata dal rilevamento di un'elevata produzione intracellulare di GM-CSF e di una bassa espressione di altre citochine specifiche delle cellule T helper.

Questo video mostra un test colorimetrico per determinare l'attività di degranulazione dei mastociti. L'enzima rilasciato dai mastociti idrolizza il substrato e produce un prodotto colorato. L'attività di degranulazione dei mastociti è stata misurata come la percentuale di rilascio di enzimi all'esterno della cellula normalizzata con il contenuto totale di enzimi nella cellula.

In questo video, descriviamo un protocollo per lo smistamento basato sulla citometria a flusso di sottopopolazioni di cellule B naive, cellule B di memoria e plasmablasti da cellule B del sangue periferico umano. Le diverse sottopopolazioni di cellule B possono essere distinte in base al legame degli anticorpi basati su fluorofori ai recettori CD19, CD27 e CD38 espressi sulla superficie delle cellule B, seguito dallo smistamento cellulare.

Questo video dimostra l'uso del test ELISpot per valutare la funzione delle cellule B che secernono anticorpi, ASC. Gli anticorpi secreti dalle ASC interagiscono con i frammenti di anticorpi policlonali legati alla membrana, che vengono rilevati dagli anticorpi IgG o IgM coniugati con enzimi. La macchia colorata prodotta in ogni pozzetto indica la presenza dell'isotipo dell'anticorpo specifico, che è correlato all'attività secretoria delle cellule B.

In questo video, descriviamo un protocollo per isolare singole cellule da linfonodi drenanti pancreatici murini (PDLN) e la caratterizzazione delle cellule T regolatorie (Treg) dalla popolazione di singole cellule utilizzando la citometria a flusso. Le Treg sono identificate in base all'espressione positiva dei marcatori di superficie cellulare CD4, CD25 e Nrp1, insieme ai fattori di trascrizione nucleare Foxp3 e Helios.

Fonte: Bello-Gamboa, A. et al., Imaging della sinapsi immunologica umana.J. Vis. Exp.(2019)
Questo video dimostra lo studio in vitro della formazione di sinapsi immunologiche tra una cellula presentante l'antigene e i linfociti T helper utilizzando un microscopio a fluorescenza. I recettori delle cellule T helper dei linfociti T helper interagiscono con un complesso antigene-MHC-II nelle cellule presentanti l'antigene e formano sinapsi immunologiche, seguite da movimenti delle vescicole...

In questo video, dimostriamo una tecnica basata sulla citometria a flusso per determinare la proporzione di cellule T killer indotte da citochine, cellule CIK, espanse da una coltura cellulare mononucleata nel sangue periferico.

Questo video mostra un metodo di imaging per visualizzare la secrezione di interferone-gamma in situ (IFN-γ) nella milza del topo. In seguito all'infezione batterica e all'induzione dell'accumulo di IFN-γ all'interno delle cellule T e delle cellule natural killer, la milza viene prelevata dal topo. Dopo aver ottenuto sezioni di tessuto, viene eseguita l'immunocolorazione per visualizzare l'IFN-γ all'interno delle cellule.

In questo video, descriviamo un protocollo per l'immunocolorazione e la visualizzazione basata sulla microscopia confocale di trappole extracellulari per macrofagi (MET) nel tessuto polmonare murino. I macrofagi residenti nei tessuti sono caratterizzati dall'espressione del marcatore glicoproteico di superficie F4/80 macrofagico-specifico, mentre i MET sono visualizzati marcando i marcatori MET della matrice metalloproteinasi 9, istone H3 citrullinato e cromatina extracellulare.

Questo video dimostra un'efficiente tecnica di omogeneizzazione per generare un'emulsione antigene-adiuvante per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in un modello murino. L'emulsione contiene un autoantigene - la glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG) - in fase acquosa, circondata da una fase oleosa continua comprendente un batterio patogeno inattivato. L'emulsione garantisce un rilascio prolungato di antigeni per una risposta immunitaria prolungata.

Questo video dimostra la visualizzazione dei linfociti intraepiteliali γδ (IEL) in topi transgenici utilizzando la microscopia confocale. La procedura chirurgica prevede la creazione di una linea di perforazione e l'esecuzione di un'incisione longitudinale per esporre la mucosa intestinale e i villi. I topi transgenici esprimono proteine reporter esclusivamente in γδ IEL, permettendone il tracciamento. L'imaging intravitale cattura il movimento dinamico dei γδ IEL marcati con fluorescenza verde...

Questo video dimostra la generazione e l'isolamento di microparticelle derivate dai linfociti T, LMP, dai linfociti T dopo il trattamento con actinomicina-D.

Questo video descrive un protocollo per isolare le cellule T CD8+ specifiche per l'antigene raro utilizzando cellule artificiali presentanti l'antigene (aAPC) basate su nanoparticelle magnetiche funzionalizzate con MHC-Ig caricate con peptidi antigenici e anticorpi anti-CD28. L'interazione delle aAPC con le cellule T CD8+ che esprimono specificamente i recettori delle cellule T antigeniche bersaglio per i peptidi, seguita dalla loro espansione in vitro, provoca l'arricchimento e l'espansione di...

Questo video dimostra la separazione dei neutrofili dalle secrezioni tracheali utilizzando un dispositivo microfluidico con canali a spirale. Il dispositivo raggiunge una separazione efficiente in base alle dimensioni delle celle utilizzando spessori variabili e canali di forma trapezoidale. L'interazione tra le forze provoca l'accumulo di neutrofili di grandi dimensioni vicino alla parete interna, mentre gli eritrociti e gli aggregati di mucina rimangono vicino alla parete esterna, garantendo...

In questo video, dimostriamo la radiomarcatura intracellulare delle cellule T helper utilizzando anticorpi monoclonali coniugati con isotopi radioattivi per l'imaging non invasivo della tomografia a emissione di positroni.