Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento e coltivazione di PMC mediante lavaggio intraperitoneale
- Isolamento PMC mediante lavaggio intraperitoneale
- Prima dell'isolamento cellulare, preparare i materiali elencati nella Tabella 1.
- Utilizzare topi maschi di età compresa tra 8 e 14 settimane per l'isolamento PMC. Eutanasia di un topo per inalazione di CO2 e confermare la morte per perdita di riflessi. Spruzzare il mouse con etanolo al 70% e fissarlo su un blocco di schiuma usando degli spilli (lato dorsale rivolto verso il basso). Rimuovere la pelle ventrale del mouse usando le forbici a lama smussata. Evitare di danneggiare la cavità peritoneale.
nota: Utilizziamo tipicamente questo protocollo per i topi con un background genetico di ceppo C57BL/6N.
- Iniettare 7 ml di terreno RPMI ghiacciato e 5 ml di aria nella cavità peritoneale utilizzando una siringa da 10 ml dotata di ago da 27 G. Spingere con cautela l'ago nel peritoneo e non perforare alcun organo. Utilizzare un punto nella regione del grasso dell'epididimo per ridurre il rischio di perforazione degli organi.
- Dopo l'iniezione, agitare il topo per 1 minuto per staccare le cellule peritoneali nel terreno RPMI. Non scuotere il topo troppo forte, per evitare di danneggiare gli organi interni e contaminare la cavità peritoneale con il sangue.
- Riutilizzare la siringa da 10 ml dotandola di una nuova cannula da 20 G. Sposta gli organi interni da un lato inclinando il blocco di schiuma e picchiettandolo delicatamente sul banco per facilitare l'aspirazione media dall'altro lato. Inserire un ago da 20 G, smussare verso l'alto e aspirare il fluido dall'addome delicatamente e lentamente (~0,5 ml/s) per evitare l'ostruzione da parte degli organi interni. Raccogliere quanto più liquido possibile (in genere 5-6 ml).
- Rimuovere l'ago dalla siringa e trasferire la sospensione cellulare raccolta in una provetta di raccolta con ghiaccio. Gettare una provetta del campione se c'è una contaminazione visibile del sangue.
- Centrifugare le provette con la sospensione cellulare a ~300 x g per 5 minuti. Sotto una cappa sterile aspirare il surnatante. Per ogni topo, combinare i pellet di campione in 4 mL di terreno PMC freddo (4-10 °C) e trasferire la sospensione cellulare in un pallone di coltura da 25 cm2. Aggiungere i fattori di crescita IL-3 e SCF alle concentrazioni finali di 10 ng/mL e 30 ng/mL, rispettivamente. Mettere il pallone contenente le cellule in un incubatore (37 °C e 5% CO2) e incubare per ~48 ore fino alla procedura successiva.
- Cultura PMC
- Giorno 2 (~48 h dopo l'isolamento): Variazione media
- Per rimuovere il surnatante e le cellule non aderenti (eritrociti e cellule morte), aspirare il terreno dal pallone posizionando un puntale di pipetta Pasteur sul bordo del pallone e tenendo il pallone quasi orizzontalmente. Aggiungere 4 ml di PMC Medium preriscaldato per topo. Aggiungere i fattori di crescita IL-3 (10 ng/mL) e SCF (30 ng/mL). Porre il matraccio contenente le cellule in un incubatore (37 °C e 5% CO2).
- Giorno 9: Divisione delle celle
- Trasferire la sospensione cellulare dal pallone di coltura cellulare in una provetta da centrifuga di plastica da 50 mL. Lavare il matraccio tre volte con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) preriscaldata (37 °C), raccogliendo la sospensione cellulare con le cellule staccate nella stessa provetta da centrifuga di plastica da 50 mL. Contare la concentrazione cellulare con un emocitometro e calcolare il numero totale di cellule.
- Centrifugare la sospensione cellulare a ~300 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante. Recuperare il pellet in un terreno PMC preriscaldato (37 °C) per ottenere la concentrazione di 1 x 106 cellule/mL. Trasferire la sospensione cellulare in un nuovo matraccio di coltura da 25 cm2. Scartare il vecchio pallone con i fibroblasti aderenti al fondo.
- Aggiungere i fattori di crescita IL-3 (10 ng/mL) e SCF (30 ng/mL) e porre il pallone contenente le cellule in un incubatore (37 °C e 5% CO2).
- Giorni 12-15: Misurazioni delle celle
- Se sono previsti esperimenti con la stimolazione dei recettori FcɛRI, pretrattare le cellule durante la notte con 300 ng/mL di IgE anti-DNP in un terreno di coltura standard.
2. Misurazione del rilascio di beta-esosaminidasi nei PMC
- Prima delle misurazioni, preparare i materiali elencati nella Tabella 2.
NOTA: La β-esosaminidasi rilasciata dalle MC dopo la loro stimolazione idrolizza la p-nitrofenil-acetil-D-glucosamina (pNAG) in p-nitrofenolo e N-acetil-D-glucosamina. La quantità di β-esosaminidasi nel campione è proporzionale alla quantità di p-nitrofenolo che si formerà. In un ambiente ad alto pH di "soluzione di arresto", il p-nitrofenolo esiste come p-nitrofenolato completamente deprotonato e può essere rilevato dalla sua assorbanza della luce a 405 nm.
- Preparare la soluzione di Tyrode contenente 130 mM di NaCl, 5 mM di KCl, 1,4 mM di CaCl2, 1 mM di MgCl2, 10 mM di HEPES, 5,6 mM di glucosio e BSA 0,1%. Regolare il pH a 7,4 con 3 M NaOH.
- Preparare la soluzione di lisi aggiungendo un volume dell'1% di Triton X-100 alla soluzione di Tyrode.
- Preparare la soluzione di arresto composta da 200 mM di glicina e regolare il pH a 10,7 con NaOH.
- Preparare la soluzione di pNAG (4-nitrofenil 2-acetammido-2-deossi-β-D-glucopiranoside) sciogliendo il pNAG in acido citrico 0,4 M fino a una concentrazione finale di 4 mM.
- Calcolare la quantità di cellule necessarie per il test (eseguire il test in duplicato). Utilizzare 200.000 PMC per pozzetto. Utilizzare 2 pozzetti come controlli negativi (soluzione di Tyrode senza secretagoghi come DNP o composto 48/80) e 2 pozzetti come controlli positivi (soluzione di Tyrode con 10 μM di ionomicina) per ogni genotipo.
- Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga di plastica da 15 mL, regolare il volume a 15 mL con la soluzione di Tyrode e centrifugare a 200 x g per 4 minuti. Rimuovere il surnatante con una pipetta di Pasteur e risospendere le cellule nella soluzione di Tyrode in 2 x 106 cellule/mL.
- Trasferire 100 μl di sospensione cellulare per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V. Aggiungere 25 μl di soluzione di stimolazione o di controllo a ciascun pozzetto (secondo lo schema di pipettaggio illustrato nella Figura 1A). Incubare le cellule per 45 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
- Arrestare la reazione posizionando la piastra a 96 pozzetti sul ghiaccio per 5 minuti. Quindi, centrifugare la piastra a 4 °C per 4 minuti a 120 x g. Trasferire 120 μl di surnatante utilizzando una pipetta multicanale su una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti e posizionarla sul ghiaccio. Evitare accuratamente di toccare i pellet delle cellule, ma aspirare completamente il surnatante.
- Aggiungere 125 μl di tampone di lisi ai pellet cellulari. Incubare i pellet cellulari per 5 minuti a temperatura ambiente e risospenderli dopo l'incubazione mediante pipettaggio ripetuto (circa 5 volte).
- Pipettare 25 μl della soluzione di pNAG (4 mM) nei pozzetti richiesti di una nuova piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. Aggiungere 25 μl di ciascun surnatante alla soluzione di pNAG preparata e 25 μl di ciascun lisato cellulare.
- Incubare i lotti di reazione per 1 ora a 37 °C. Dopo l'incubazione, pipettare 150 μL di soluzione di arresto in ciascun pozzetto per arrestare la reazione.
- Analizza la piastra con un lettore di micropiastre utilizzando un'impostazione a doppia lunghezza d'onda a 405 nm con riferimento 630 nm per la sottrazione automatica dello sfondo. Nel programma di ripresa, spuntare la casella "Riferimento" e nel menu degli elementi del programma "Assorbanza", selezionare "630 nm" dall'elenco a discesa. Se la densità ottica dei campioni è troppo elevata, preparare un'adeguata diluizione della sonda prima di rimisurare.
Tabella 1: Materiali per il passaggio 1.
| 1 | ghiaccio |
| numero arabo | Siringhe da 10 mL |
| 3 | Ferri da 27 g |
| 4 | Ferri da 20 g |
| 5 | Blocco e perni in polistirolo |
| 6 | Provette di raccolta (provette da centrifuga in plastica da 50 mL) |
| 7 | 70% etanolo |
| 8 | RPMI Medium (Pre refrigerato e conservato in ghiaccio) |
| 9 | PMC Medium: RPMI Medium + 20% FCS (siero fetale di vitello) + 1% penicillina e streptomicina (Pen-Streptomyc) |
| 10 | Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco - DPBS (senza Ca2+ e Mg2+) |
| 11 | Fiasche di coltura (25 cm) |
| 12 | Fattori di crescita soluzioni stock (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL) |
| 13 | Pipette sierologiche (10 mL) |
| 14 | Puntali per pipette sterili (20-200 μl) |
| 15 | Emocitometro |
| 16 | Centrifuga da banco |
| 17 | Forbici e pinze |
| 18 | Camera CO2 per topi |
| 19 | Aprire il cappuccio sterile |
| 20 | Cappuccio sterile chiuso |
| 21 | Incubatore cellulare (37 °C e 5% CO2) |
| 22 | Pipette di trasferimento (20-200 μl) |
Tabella 2: Materiali per il passaggio 2.
| 1 | PMC (12-15 giorni) 1 x 106 cellule/mL |
| numero arabo | Soluzione madre anti-DNP-anticorpi (IgE) |
| 3 | Soluzione stock DNP-HSA |
| 4 | Soluzione madre composta 48/80 |
| 5 | Ionomicina |
| 6 | Piastra a 96 pozzetti, fondo a V |
| 7 | Piastre a 96 pozzetti, fondo piatto |
| 8 | Provette da centrifuga in plastica (15 mL) |
| 9 | Pipette sierologiche |
| 10 | Incubatore cellulare (37 °C e 5% CO2) |
| 11 | Centrifuga da banco |
| 12 | Lettore di piastre per microtitolazione per misure di densità ottica |
| 13 | Pipetta multicanale (20-200 μL) |
| 14 | Emocitometro |
