Isolamento e coltura di cellule di Kupffer di topo

Abstract

Fonte: Bourgognon, M., et al. Isolamento cellulare di Kupffer per test di tossicità da nanoparticelle. J. Vis. Exp. (2015)

In questo video, dimostriamo l'isolamento delle cellule di Kupffer o dei macrofagi epatici dal fegato del topo. Il fegato viene perfuso con una soluzione digestiva seguita da separazione in gradiente di densità. Le cellule di Kupffer aderenti isolate possono essere utilizzate per ulteriori analisi.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Perfusione e raccolta cellulare (Figura 1)

1. Preparare di fresco tutti i reagenti descritti nella tabella dei materiali.
2. Riscaldare la soluzione EGTA (acido etilenglicole tetraacetico)/HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank) (50 ml per topo) e la soluzione di collagenasi (100 ml per topo) per 30 minuti a 40 °C.
3. Sciacquare prima il tubo flessibile della pompa con etanolo al 70%. Versare 40 ml di soluzione EGTA/HBSS in una provetta da centrifuga immersa nel bagno d'acqua e sciacquare il tubo flessibile della pompa con la soluzione EGTA/HBSS preriscaldata.
4. Eseguire l'anestesia terminale utilizzando un barbiturico per produrre in modo affidabile lo stato di incoscienza prima della depressione respiratoria e della morte. Iniettare fenobarbitone a 1 mg/kg, i.p. in un topo CD1 femmina o maschio (35-45 g). Confermare l'anestesia pizzicando le dita dei piedi.
5. Radere i peli addominali e sterilizzare la superficie addominale utilizzando una soluzione di etanolo al 70%.
6. Tagliare la cavità addominale ed esporre la vena porta e la vena cava inferiore spostando l'intestino lateralmente a sinistra dell'addome.
7. Avviare la pompa a una velocità di 1-3 ml/min con la soluzione EGTA/HBSS e incannulare la vena porta utilizzando un ago a farfalla da 23 g (taglio ad ali). Bloccare la sezione della vena porta cannulata con l'ago da 23 G e quindi capovolgere la pinza serrefine sulla superficie dell'addome aperto del topo. Il fegato dovrebbe impallidire rapidamente entro i primi 30 secondi di perfusione della soluzione EGTA/HBSS.
8. Incidere rapidamente la parte inferiore della vena cava inferiore per evitare l'accumulo di una pressione eccessiva nel fegato, quindi aumentare gradualmente la velocità di flusso fino a 7 ml/min, durante il primo minuto di perfusione. L'animale muore a causa di un'emorragia secondaria alla venipuntura della vena cava.
9. Quando nella provetta da centrifuga rimangono meno di 5 ml di soluzione EGTA/HBSS, riempirla con la soluzione di collagenasi (40-50 ml). Aumentare gradualmente la portata fino a 10 ml/min, nell'arco di 30 sec.
10. Fai gonfiare il fegato applicando pressione sulla vena cava inferiore, usando una pinzetta, per intervalli di 5-10 secondi. Questo può essere fatto periodicamente (5-10 volte durante la digestione). Questo passaggio migliorerà la dissociazione delle cellule epatiche e ridurrà il tempo di perfusione con la collagenasi.
11. Quando rimangono meno di 10 ml di soluzione di collagenasi all'interno della provetta da centrifuga, versare 40-50 ml di soluzione di collagenasi preriscaldata nella provetta da centrifuga.
12. Dopo 10-15 minuti di perfusione e circa 70-80 ml di soluzione di collagenasi perfusi, applicare una piccola pressione sulla superficie del fegato con una pinza. Un'impronta della pressione indica che le cellule del fegato sono dissociate.
13. Rimuovere il fegato dalla cavità addominale in un unico pezzo e metterlo in una provetta da centrifuga contenente 20-30 ml di terreno di isolamento delle cellule di Kupffer. Mantenere le cellule epatiche in ghiaccio o a 4 °C per un periodo massimo di 3 ore per evitare di compromettere la vitalità delle cellule epatiche.
14. Ripetere la procedura di perfusione su più animali, se necessario, mantenendo il fegato perfuso sul ghiaccio. Raggruppare da uno a tre fegati per la purificazione e procedere con la fase 3.

2. Preparazione del gradiente di densità per la centrifugazione (Figura 2)

1. Procedere con i seguenti passaggi (sezioni 2, 3 e 5) in condizioni sterili e mantenere le cellule su ghiaccio o a 4 °C. Preparare la SIP (soluzione di particelle di silice rivestite isotoniche) mescolando 15,3 ml di soluzione di particelle di silice rivestite con 1,7 ml di 10 x PBS.
2. Per preparare 20 ml di soluzione SIP al 25%, mescolare 5 ml di SIP con 15 ml di PBS. Per preparare 20 ml di soluzione SIP al 50%, mescolare 10 ml di SIP con 10 ml di PBS.
3. Riempire una provetta da centrifuga con 20 ml della soluzione SIP al 50%. Inclinare la provetta da centrifuga con un angolo vicino a 90° e aggiungere lentamente la soluzione SIP al 25% (20 ml) sulla parete laterale della provetta utilizzando una pipetta sierologica da 25 ml, senza toccare la superficie dello strato SIP al 50%. Quando si aggiunge la soluzione SIP al 25%, ridurre progressivamente l'angolo del tubo. Mantenere il gradiente di densità sul ghiaccio fino all'uso.

3. Purificazione cellulare Kupffer (Figura 3)

1. Mettere un fegato perfuso in una capsula di Petri con 15 ml di terreno di isolamento cellulare Kupffer. Rompere la capsula di Glisson (membrana del fegato) usando le forbici e rilasciare tutte le cellule del fegato nel mezzo di isolamento delle cellule di Kupffer. Filtrare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 100 μm per essere raccolta in una provetta da centrifuga. Ripetere la procedura di perfusione su altri fegati perfusi e riunire le cellule nella stessa provetta da centrifuga (15 ml da un topo e fino a 45 ml da tre topi).
2. Centrifugare la sospensione cellulare a 50 x g per 2 minuti a 4 °C. Le cellule parenchimali (epatociti) saranno nel pellet e le cellule non parenchimali (comprese le cellule di Kupffer) saranno nel surnatante.
3. Raccogliere il surnatante in una provetta da centrifuga pulita e centrifugare a 50 x g per 2 minuti ciascuno. Ripeti questo passaggio altre tre volte.
4. Centrifugare a 1.350 x g per 15 minuti per pellettare cellule non parenchimali. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di terreno di isolamento cellulare Kupffer.
5. Aggiungere la soluzione cellulare non parenchimale sul gradiente isotonico discontinuo 25/50% come descritto al punto 2.3. Centrifugare a 850 x g per 15 minuti senza accelerazioni o interruzioni.
6. Localizzare la frazione di cella di Kupffer arricchita che appare torbida all'interno della frazione SIP al 25% vicino all'interfaccia SIP al 25/50% (Figura 3). Utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml, aspirare circa 12 ml della frazione cellulare di Kupffer arricchita. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga contenente 35-40 ml di terreno di isolamento cellulare Kupffer. Mescolare delicatamente e centrifugare a 1.350 x g per 15 minuti a 4 °C fino a formare celle a pellet.
7. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 5-10 ml di terreno di coltura cellulare Kupffer preriscaldato. Contare le cellule (emocitometro) e misurare la vitalità utilizzando la colorazione con blu di tripano.
8. Piastra le cellule non parenchimali purificate in piastre a 24 pozzetti a una densità di 5 x 10⁵ cellule/pozzetto. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO₂ (Figura 3). Dopo 30 minuti, rimuovere delicatamente il terreno, lavare con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) preriscaldata una volta, quindi sostituirla con 500 μl di terreno di coltura cellulare Kupffer fresco e preriscaldato (per pozzetto).

Risultati

Figura 1: Perfusione epatica. Dopo l'anestesia del topo, il tubo digerente viene spostato lateralmente a sinistra dell'addome per rendere accessibile la vena porta (PV). La PV viene incannulata utilizzando una velocità di flusso lenta (1-3 ml/min) di soluzione EGTA/HBSS e la vena cava inferiore (IVC) viene immediatamente rotta per evitare qualsiasi eccesso di pressione all'interno del fegato. Entro i...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Euthatal (pentobarbital sodico)	Merial
Topi CD1	Fiume Carlo	-	Il peso del mouse dovrebbe variare da 35 a 45 g. Si consiglia l'uso di topi CD1 maschi poiché il loro peso aumenta rapidamente (ad esempio, un topo CD1 maschio di 7 settimane supera i 35 g di peso). Si consiglia inoltre di contattare in anticipo il fornitore dell'animale per organizzare la consegna degli animali più anziani. In alternativa, gli animali possono essere ospitati per raggiungere il peso desiderato.
HBSS (senza Ca2+ e Mg2+, con bicarbonato)	Tecnologie per la vita	Codice 14175-053	HBSS deve essere libero da Ca2+.
Sale tetrasodico dell'acido etilenglicole tetraacetico (EGTA)	Sigma-Aldrich	E8145	L'EDTA può essere utilizzato, ma l'EGTA ha il vantaggio di chelare il Ca2+ in modo selettivo.
HEPES (1M)	Tecnologie per la vita	Codice 15630-056	Confezione da 100 ml
Collagenasi di tipo IV	Worthington	CSL-4	Si consiglia di testare diversi lotti di collagenasi o almeno di menzionare al fornitore che il prodotto deve essere adatto all'isolamento delle cellule epatiche
DMEM a basso contenuto di glucosio	Sigma-Aldrich	D5523	Flacone da 500 ml
RPMI (con piruvato di sodio e Glutamax®)	Tecnologie per la vita	Codice 12633-012	Flacone da 500 ml
Penicillina/Steptomicina	Tecnologie per la vita	Codice: 15140-122	Confezione da 100 ml
Siero fetale bovino	Primo collegamento	60-00-850	Flacone da 500 ml
Soluzione di tripano blu	Sigma-Aldrich	T8154	Confezione da 100 ml
Soluzione di particelle di silice rivestita (Percoll®)	GE Healtcare	Codice 17-0891-02	Il Percoll® è molto stabile e può essere conservato per diversi anni
1x soluzione salina tamponata con fosfato	Tecnologie per la vita	Codice 10010-023	Flacone da 500 ml
10x soluzione salina tamponata con fosfato	Tecnologie per la vita	Codice: 70011-036	Flacone da 500 ml
Set per la raccolta del sangue a farfalla (tubo lungo 23 G/305 mm)	Bd	367288
Filtri per siringhe (bordo blu da 0,22 μm)	Minisart	16534-K
Provette da centrifuga (tappo blu da 50 ml)	BD Bioscienze, Falco	35 2070
Piastra di Petri (90 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientifico	BSN 101VR20
Filtro cellulare da 100 μm	Bd	Codice 352360
Pompa peristaltica	Watson Marlow	SciQ 300	Sciacquare i tubi prima e dopo ogni utilizzo con PBS sterile ed etanolo al 70%.
Piastre a 24 pozzetti	Corning	Codice: 3526
centrifuga	Eppendorf	5810R
Forcipe Serrefine	Hammacher GmbH	Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051	La pinza serrefine consente di bloccare il vaso incannulato con l'ago 23G senza la necessità di tenere la pinza durante la procedura di perfusione. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
Raschietto per celle	BD Bioscienze, Falco	353086	Tagliare le estremità della lama con un paio di forbici per raschiare le cellule in piastre a 24 pozzetti.
Soluzione EGTA (acido etilenglicole tetraacetico)/HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank)			HBSS contenente 0,5 mM EGTA e 25 mM HEPES. Regolare il pH a 7,4. Preparare 50 ml per ogni fegato da perfondere.
Soluzione di collagenasi			DMEM a basso contenuto di glucosio contenente collagenasi di tipo IV a 100 UI/ml, 15 mM HEPES e 1% Penicillina/Streptamicina (v/v). Regolare il pH a 7,4. Preparare 100 ml per ogni fegato da perfondere. Dopo aver aggiunto la collagenasi, si consiglia di riscaldare la soluzione per 30 minuti prima dell'uso. Ciò consente all'attività della collagenasi di essere ottimale.
Terreno di isolamento cellulare Kupffer			RPMI contenente, 1% di aminoacidi non essenziali (v/v), 1% di glutamax® (v/v) e 1% di penicillina/streptomicina (v/v). Preparare almeno 100 ml per 1-3 fegatini.
Terreno di coltura cellulare Kupffer			RPMI contenente il 10% di siero fetale bovino, l'1% di aminoacidi non essenziali (v/v), l'1% di glutamax® (v/v) e l'1% di penicilina/streptamicina (v/v). Preparare almeno 100 ml per 1-3 fegatini.
SIP (soluzione di particelle di silice rivestite isotoniche)			Mescolare 1,7 ml di soluzione salina tamponata con fosfato 10x con 15,3 ml di Percoll® per ottenere 17 ml di SIP.
Soluzione SIP al 25%			Mescolare 5 ml di SIP con 15 ml di soluzione salina tamponata con 1 fosfato
Soluzione SIP al 50%			Mescolare 10 ml di SIP con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato
Tampone di lisi			Supporti DMEM con Triton X-100 allo 0,9%
Soluzione PBS/BSA			Preparare soluzione salina fresca tamponata con fosfato a pH 7,4 con albumina sierica bovina all'1%.