Differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo in macrofagi

Abstract

Fonte: Lopez-Yrigoyen, M., et al. Produzione e caratterizzazione di macrofagi umani da cellule staminali pluripotenti. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video descrive un metodo in vitro per generare macrofagi da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC). La generazione di macrofagi da iPSCs avviene in tre fasi: (i) aggregazione di iPSCs in sospensione per formare corpi embrioidi tridimensionali (EB) che si differenziano in cellule mesodermiche, (ii) formazione di cellule precursori dei macrofagi dalle EB differenziate e (iii) differenziazione delle cellule precursori dei macrofagi in macrofagi maturi e funzionali.

Protocollo

1. Differenziazione delle iPSC umane dai macrofagi

NOTA: Un riassunto schematico del protocollo di differenziazione dei macrofagi è illustrato nella Figura 1.

1. Preparazione di fattori di crescita per la differenziazione cellulare e altri reagenti
   1. Preparare terreni privi di siero di cellule staminali embrionali umane (hESC-SFM; vedi Tabella dei materiali) integrando il terreno Eagle modificato di Dulbecco-F12 (DMEM/F12) con un integratore di hESC, 1,8% p/v di albumina sierica bovina (BSA) e 0,1 mM di 2-mercaptoetanolo.
   2. Preparare una soluzione allo 0,1% p/v di gelatina suina sciogliendo la gelatina in acqua sterile. La soluzione di gelatina può essere conservata a 4 °C per un massimo di 2 anni.
   3. Preparare la soluzione madre di proteina morfogenetica ossea umana (BMP4) (25 μg/mL) sciogliendo BMP4 in una soluzione di 4 mM di cloruro di idrogeno (HCl)-0,2% BSA PBS. Distribuire la soluzione madre in aliquote da 50 μL in crioprovette. Le soluzioni madre possono essere conservate a -20 °C per un massimo di 1 anno. Una volta scongelato, il BMP4 stock può essere conservato a 4 °C per 5 giorni.
   4. Preparare la soluzione madre del fattore di crescita dell'endotelio vascolare umano (VEGF) (100 μg/mL) sciogliendo il VEGF in una soluzione BSA PBS allo 0,2%. Distribuire la soluzione madre in aliquote da 10 μL in crioprovette. Le soluzioni madre possono essere conservate a -20 °C per un massimo di 1 anno. Una volta scongelato, il VEGF stock può essere conservato a 4 °C per 7 giorni.
   5. Preparare la soluzione madre di fattore di cellule staminali umane (SCF) (100 μg/mL) sciogliendo l'SCF in una soluzione di BSA PBS allo 0,2%. Distribuire la soluzione madre in aliquote da 5 μL in crioprovette. Le soluzioni madre possono essere conservate a -20 °C per un massimo di 1 anno. Una volta scongelato, l'SCF stock può essere conservato a 4 °C per 10 giorni.
   6. Preparare la soluzione madre di interleuchina-3 umana (IL3) (10 μg/mL) sciogliendo IL3 in una soluzione PBS BSA allo 0,2%. Distribuire la soluzione madre sotto forma di aliquote da 500 μL in crioprovette. Le soluzioni madre possono essere conservate a -20 °C per un massimo di 2 anni. Una volta scongelato, il materiale di produzione IL3 può essere conservato a 4 °C per 15 giorni.
   7. Preparare la soluzione madre del fattore stimolante le colonie di macrofagi umani (CSF1) (10 μg/mL) sciogliendo il CSF1 in una soluzione PBS BSA allo 0,2%. Distribuire la soluzione madre in aliquote da 1 mL in crioprovette. Le soluzioni madre possono essere conservate a -20 °C per un massimo di 2 anni. Una volta scongelato, il CSF1 madre può essere conservato a 4 °C per 15 giorni.
2. Fase 1: Generazione di corpi embrioidi (giorno 0-giorno 3)
   1. Il giorno 0, aggiungere 2,25 mL di terreno di Fase 1 (hESC-SFM integrato con 50 ng/mL di BMP4, 50 ng/mL di VEGF e 20 ng/mL di SCF) in due pozzetti di piastre a 6 pozzetti con attacco ultrabasso.
   2. Sostituire il terreno di manutenzione di un pozzetto confluente all'80% di iPSC in una piastra a 6 pozzetti con 1,5 mL di terreno di fase 1.
   3. Tagliare le colonie utilizzando lo strumento di passaggio cellulare e trasferire le colonie tagliate con una pipetta nei due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con attacco ultrabasso (vedere la Tabella dei materiali).
   4. Il giorno 2, portare le citochine a una concentrazione finale di 50 ng/mL di BMP4, 50 ng/mL di VEGF e 20 ng/mL di SCF utilizzando 0,5 mL di terreno hESC-SFM.
      nota: Le colonie IPSC diventeranno EB (Figura 2A).
3. Fase 2: Comparsa di cellule ematopoietiche in sospensione
   1. Il giorno 4, rivestire 4 pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti con gelatina allo 0,1% p/v e incubare per almeno 10 minuti.
   2. Rimuovere la gelatina e aggiungere 2,5 mL di terreno di Fase 2 (X-VIVO15 integrato con 100 ng/mL di CSF1, 25 ng/mL di IL-3, 2 mM di glutamax, 1% di penicillina-streptomicina e 0,055 mM di 2-mercaptoetanolo).
   3. Raccogliere gli EB formati in una provetta da centrifuga da 50 mL e lasciarli depositare sul fondo della provetta per gravità. Aspirare con cura il fluido.
   4. Risospendere gli EB in 2 mL di terreno di Fase 2.
   5. Trasferire 10-15 EB (non più di 15) in un pozzetto rivestito di gelatina contenente 2,5 mL di terreno di Fase 2.
   6. Incubare gli EB a 37 °C e al 5% di CO₂ nell'aria.
   7. Cambiare i terreni sugli EB placcati ogni 3-4 giorni per 2-3 settimane.
   8. Dopo 2-3 settimane, gli EB iniziano a rilasciare cellule ematopoietiche non aderenti in sospensione.
      nota: Questo periodo di rilascio della cellula in sospensione può variare ed è dipendente dalla linea cellulare. Le cellule di questa sospensione possono essere raccolte e maturate in macrofagi (vedi Stadio 3) (Figura 2A).
4. Fase 3: Maturazione terminale dei macrofagi
   1. Raccogliere le cellule ematopoietiche in sospensione e reintegrare il terreno (terreno di stadio 2) sulla piastra EB.
   2. Centrifugare le celle di sospensione a 200 x g per 3 min.
   3. Risospendere le cellule in sospensione in terreni di stadio 3 (X-VIVO15 integrato con 100 ng/mL di CSF1, 2 mM di glutamax e 1% di penicillina-streptomicina).
   4. Le cellule raccolte e centrifugate su piastre di plastica non trattate, di grado batteriologico da 10 cm (10 mL) o piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti non rivestite (3 mL) a una densità di 0,2 x 10,⁶ cellule/mL.
   5. Conservare le celle nei terreni di fase 3 per 9-11 giorni, cambiando i terreni ogni 5 giorni.
      nota: I passaggi 1.4.1-1.4.5 della fase 3 possono essere ripetuti ogni 3-4 giorni e le celle di sospensione possono essere prelevate dalla piastra EB originale per un massimo di 3 mesi.

Risultati

Figura 1: Sintesi grafica del differenziamento delle iPSC nei macrofagi funzionali maturi. Diagramma disegnato con Biorender.

Figura 2: differenziazione delle iPSC verso i macrofagi e numero e morfologia delle iPSC-DM. (A) Immagini in ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
CellMask Colorazione della membrana plasmatica rosso intenso	Thermofisher	Visualizzazione del materiale C10046	Terreni di crioconservazione
Criostore CS10	sigma	Codice: C2874
Substrato CTS CELLstart	Invitrogen	A1014201	Substrato di cellule staminali
Gelatina per pelle suina	sigma	G9136
Proteina BMP4 umana ricombinante	Ricerca e Sviluppo	314-BP-010
IL3 umana ricombinante	Preprotech	0200-03-10
MCSF umano ricombinante (senza carrier) 100ug	Bioleggenda	574806
Proteina VEGF umana ricombinante	Ricerca e Sviluppo	293-VE-010
SCF (C-Kit Ligand) Proteina umana ricombinante	Thermofisher	PHC2111
StemPro hESC SFM	Thermofisher	A1000701
Strumento di passaggio delle cellule staminali monouso StemPro EZPassage	Thermofisher	23181010
Piastre di fissaggio ultrabasse: Piastra multipozzetto per colture cellulari, 6 pozzetti, superficie repellente per cellule a stella cellulare	Greiner	Codice 657970
2-Mercaptoetanolo (50 mM)	Invitrogen	31350010
DPBS, calcio, magnesio (500ml)	Thermofisher	14040091
Integratore GlutaMAX	Thermofisher	35050061