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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università della California di San Francisco e sono stati condotti in conformità con la Guida NIH per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio.
1. Raccogli DRG lombare da topi sperimentali
- Prima di iniziare l'esperimento, preparare la soluzione di lavoro del mezzo a gradiente di densità (ad es. Percoll) mescolando 9 volumi del mezzo con 1 volume di 10x HBSS privo di Ca++/Mg++. Tienilo in ghiaccio.
- Anestetizzare il topo con il 2,5% di Avertin. Confermare che l'animale è completamente anestetizzato dalla mancanza di risposta al pizzico della zampa posteriore.
NOTA: Sono stati utilizzati sia topi maschi che femmine di età compresa tra 6 e 8 settimane.
- Perfondere il topo per via transcardiaca con 10 mL di 1x PBS pre-raffreddato.
- Posiziona il mouse in posizione supina con quattro zampe fissate con il nastro adesivo all'interno di una cappa chimica. Solleva la pelle sotto la gabbia toracica con il forcipe e fai una piccola incisione con le forbici chirurgiche per esporre il fegato e il diaframma.
- Continuare a usare le forbici per tagliare il diaframma e la gabbia toracica e aprire la cavità pleurica per esporre il cuore pulsante.
- Taglia rapidamente l'appendice atriale destra con le forbici dell'iride. Una volta notato il sanguinamento, inserire un ago da 30 G nell'estremità posteriore del ventricolo sinistro e iniettare lentamente 10 ml di PBS 1x pre-raffreddato per perfondere l'animale.
- Eseguire la laminectomia dorsale sul topo posto in posizione prona.
nota: Se è prevista la coltura cellulare, spruzzare il topo con etanolo al 70% prima dell'incisione e utilizzare strumenti chirurgici pre-sterilizzati per la dissezione.
- Utilizzare un bisturi di misura 11 per praticare un'incisione longitudinale laterale profonda partendo dalla regione toracica fino alla regione sacrale. Rimuovere la pelle con le forbici per esporre lo strato muscolare dorsale.
- Utilizzare Friedman-Pearson Rongeur per staccare i tessuti connettivi e i muscoli fino a quando i processi della colonna lombosacrale e i processi trasversali bilaterali sono esposti.
- Usa una forbice a molla Noyes per aprire con cautela la colonna vertebrale dorsale, quindi passa a un Rongeur Friedman-Pearson per rimuovere le ossa vertebrali per esporre il midollo spinale con i nervi spinali intatti attaccati.
- Sezionare attentamente il DRG lombare omolaterale e controlaterale (L4/L5 DRG nel nostro studio) e inserirlo in 1 mL di 1x HBSS ghiacciato privo di Ca++/Mg++ in un omogeneizzatore tissutale Dounce. Ora i fazzoletti sono pronti per il passaggio 2.
nota: Se possibile, taglia il nervo spinale attaccato al DRG.
2. Isolare singole cellule dal DRG lombare di topo
- Omogeneizzare il tessuto DRG con un pestello sciolto nell'omogeneizzatore Dounce 20-25 volte.
- Inserire un colino sterile in nylon da 70 μm in una provetta conica sterile da 50 mL. Bagnare il filtro a celle con 800 μL di 1x HBSS ghiacciato e il flusso viene raccolto nella provetta conica.
- Raccogliere la sospensione tissutale omogeneizzata dall'omogeneizzatore utilizzando una pipetta e farla passare attraverso il filtro cellulare in nylon umido da 70 μm nella provetta conica da 50 mL.
- Sciacquare l'omogeneizzatore due volte con 800 μL di 1x HBSS ghiacciato e poi travasarlo nella stessa provetta conica da 50 mL con un colino cellulare per aumentare la resa.
- Aggiungere 1,5 mL di terreno a gradiente di densità isotonico ghiacciato bilanciato (preparato al punto 1.1) in una provetta FACS sterile da 5 mL in polistirene.
- Trasferire l'omogeneiato cellulare dalla provetta conica da 50 mL (al punto 2.4) nella provetta FACS e miscelare bene con il mezzo a gradiente di densità pipettando verso l'alto e verso il basso. Aggiungere altri 500 μl di 1x HBSS per sigillare la parte superiore.
- Pellettare le celle mediante centrifugazione a 800 x g per 20 min a 4 °C.
- Aspirare con cautela il surnatante contenente mielina nel terreno senza disturbare il pellet cellulare sul fondo del tubo FACS.
- Risospendere le cellule in tampone PBS o FACS contenente il 5% di siero fetale bovino (FBS) per l'analisi FACS.
nota: Ci si aspetta almeno da 50.000 a 100.000 cellule dal DRG L4/L5 di un topo.
- Risospendere le cellule DRG isolate meccanicamente (L4/L5) in 100 μL di PBS contenente il 5% di siero fetale bovino e quindi incubare con l'anticorpo CX3CR1-APC di α-topo (1:2.000) al buio a 4 °C per 1 ora.
- Lavare le cellule con 5 mL di PBS una volta; centrifugare le cellule 360 x g per 8 minuti a 4 °C.
- Aspirare il surnatante, quindi risospendere il pellet cellulare in 300 μl di PBS per l'analisi FCAS. Se è previsto l'ordinamento delle celle, risospendere le celle nel buffer FACS.