Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Fasi di escissione chirurgica e preparazione dei tessuti:
- Asportazione chirurgica dell'intestino tenue (SI)
- Sopprimere i topi utilizzando l'asfissia da CO2 o qualsiasi metodo equivalente approvato dal comitato etico animale istituzionale.
- Trasferire il topo in un'area dedicata per l'escissione chirurgica. Posizionare il retro verso il basso e igienizzare l'addome con etanolo al 70%. Eseguire una laparotomia tagliando la pelle addominale e il peritoneo lungo la linea mediana dal pube alla gabbia toracica aprendo così la cavità peritoneale><.
nota: Eseguire la prima incisione su un'area relativamente piccola della pelle per evitare di penetrare nella cavità peritoneale e danneggiare il tessuto intestinale. Continuare l'escissione fino al bordo anatomico desiderato.
- Identificare il cieco, che è un punto di riferimento ideale per la rilevazione dell'ileo terminale, che costituisce il segmento distale dell'intestino tenue.
nota: Il cieco si trova solitamente nella parte inferiore sinistra dell'addome del topo.
- Individua la giunzione ileocecale e fai un taglio a questo livello il più distale possibile per separare l'intestino tenue dal cieco. Durante i passaggi successivi, evitare un contatto fisico eccessivo con la parete intestinale perché i PP fragili collassano facilmente al tatto.
- Rimuovere delicatamente l'intero intestino tenue fino allo sfintere pilorico tagliando il mesentere con le forbici. Identificare la giunzione tra il piloro e il duodeno e tagliare il duodeno a questo livello, il che porterà al completo distacco dell'intestino tenue dalla cavità addominale><.
NOTA: (i) Evitare l'iperestensione in quanto potrebbe causare la rottura della parete intestinale. (ii) Se si desidera l'isolamento dei linfociti LP in aggiunta ai linfociti PP, è necessaria la rimozione completa del grasso mesenterico. Tuttavia, solo per l'isolamento del PP, il grasso mesenterico rimanente potrebbe fornire alcuni benefici durante le ulteriori fasi di isolamento; pertanto, dovrebbe essere preservato.
- Posizionare l'intestino tenue staccato in una piastra a 6 pozzetti riempita con RPMI freddo + 10% di siero fetale bovino (FBS) e agitare delicatamente i tessuti manualmente fino a quando tutti i segmenti intestinali non sono immersi nel mezzo freddo. Mantenere i fazzoletti sul ghiaccio durante i passaggi successivi.
- Dopo aver sezionato il numero desiderato di intestino tenue di topo, procedere all'escissione di PP dall'intestino tenue raccolto.
- Escissione chirurgica di PP e preparazione di sospensioni a singola cellula:
- Trasferire delicatamente l'intestino tenue su un tovagliolo di carta afferrando il grasso mesenterico con una pinza e posizionando il lato mesenterico rivolto verso il tovagliolo di carta. Inumidire l'intero segmento intestinale con RPMI freddo + 10% FBS per evitare la disidratazione e la viscosità dei tessuti.
nota: Il grasso mesenterico rimanente può essere utile in questa fase perché i segmenti di tessuto adiposo sul lato mesenterico del SI si attaccheranno al tovagliolo di carta mantenendo il lato anti-mesenterico rivolto verso l'alto.
- Identificare i PP, che appaiono come aggregati bianchi multilobulati a forma di "cavolfiore" sul lato anti-mesenterico della parete intestinale.
nota: Si sconsiglia di eliminare il contenuto luminale fino a quando tutti i PP non sono stati asportati. Lo svuotamento del contenuto luminale potrebbe causare il collasso dei PP e impedirà il contrasto cromatico tra i PP e la parete intestinale, il che è molto utile per l'identificazione visiva dei PP.
- Dopo aver identificato i PP sul lato anetimesenterico, posizionare la forbice chirurgica con estremità curva sui PP (la curva deve essere rivolta verso l'alto) trattenendo il PP dal suo bordo distale e prossimale.
opzionale: Spingi delicatamente il PP verso le lame delle forbici usando la punta delle dita. Questa manovra porterà a una migliore esclusione del tessuto circostante non PP. Asportare delicatamente i PP, escludendo il tessuto intestinale circostante.
NOTA: (i) Questo passaggio è fondamentale per ottenere la massima resa di cellule PP riducendo al minimo la contaminazione cellulare dai compartimenti intestinali vicini come LP ed epitelio intestinale, che sono anch'essi ricchi di cellule T. ii) Da un SI asportato da un topo C57BL/6 possono essere raccolti 5-10 PP (di dimensioni medie, multilobulati). Puntando a PP ancora più piccoli (non multilobulati), è possibile raccogliere fino a 12-13 PP per topo (C57BL/6) utilizzando questo protocollo.
- Trasferire i PP asportati in una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti riempita con RPMI ghiacciato + 10% FBS e mantenuta su ghiaccio utilizzando una pinza o forbici chirurgiche curve.
NOTA: (i) Immediatamente dopo l'escissione di PP, il contenuto di muco e intestino sulla superficie del PP può essere pulito strofinando delicatamente il fazzoletto su un tovagliolo di carta. Questo passaggio contribuirà a migliorare la vitalità dei linfociti PP. ii) Invece di trasferire i PP su una piastra, si può prendere in considerazione anche il trasferimento in provette separate a seconda del numero totale di campioni.
- Opzionale: una volta completata l'escissione del PP e il successivo posizionamento nella piastra a pozzetti, il numero e le dimensioni dei PP raccolti da diversi gruppi sperimentali/topini possono essere documentati scattando una foto della piastra di coltura tissutale contenente PP.
- Preparare un set di provette coniche da 50 mL riempite con 25 mL di RPMI + 10% FBS (preriscaldate a 37 °C). Utilizzando un paio di forbici, tagliare il bordo di un puntale da 1.000 μL dalla distanza che consentirà l'aspirazione dei PP con una pipetta da 1 mL. Aspirare i PP con una pipetta da 1 mL e trasferirli dalla piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti alle provette coniche da 50 mL preparate.
nota: Utilizzare una nuova punta per ogni campione di topo per evitare la contaminazione incrociata tra i campioni.
- Chiudere il coperchio e posizionare le provette verticalmente in un agitatore orbitale a 37 °C, agitando continuamente a 125-150 giri/min per 10 minuti. Nel frattempo, preparare un nuovo set di provette da 50 ml e posizionare un filtro cellulare da 40 μm sulla parte superiore di ciascuna provetta, attraverso il quale verrà preparata la sospensione a singola cellula.
NOTA: (i) La fase di agitazione rimuoverà il contenuto intestinale rimanente, il muco e i detriti cellulari, che riducono la vitalità cellulare e il recupero dei linfociti PP se non rimossi. (ii) Non applicare alcun tipo di enzimi digestivi sul tessuto PP perché il processo di digestione provoca una drastica perdita di espressione di CXCR5 dalla superficie cellulare.
- Dopo l'agitazione, trasferire i PP nel filtro cellulare da 40 μm posizionato sulla parte superiore delle provette coniche da 50 mL appena preparate. Utilizzando il lato arrotondato di uno stantuffo della siringa da 10 mL, disgregare delicatamente i PP attraverso il filtro cellulare per generare una sospensione a singola cellula. Sciacquare il colino con 15-20 ml di RPMI freddo + 10 % FBS.
NOTA: (i) Prima di filtrare, agitare orizzontalmente i tubi contenenti i PP. Questa breve agitazione faciliterà il trasferimento dei PP nei filtri cellulari. (ii) Si raccomanda l'uso di un filtro cellulare da 70 μm per l'isolamento di cellule immunitarie non linfoidi (ad esempio, monociti, macrofagi, DC).
- Centrifugare le sospensioni a cella singola a 350-400 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Scartare con cautela il surnatante e risospendere le cellule a una concentrazione di 10 x 106 cellule/mL. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.