Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico da Buffy Coats umani

Abstract

Fonte: Mily, A., et al. Polarizzazione di cellule derivate da monociti umani M1 e M2 e analisi con citometria a flusso su infezione da Mycobacterium tuberculosis. (2020)

In questo video, dimostriamo l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico, PBMC, contenenti monociti e linfociti da un buffy coat umano mediante centrifugazione a gradiente di densità. Le PBMC isolate possono essere utilizzate per ulteriori analisi.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Preparazione dei media

NOTA: I dettagli su tutti i reagenti e i materiali di consumo sono forniti nella Tabella dei Materiali.

1. Terreno completo RPMI: Integrare RPMI 1640 con 1 mM di piruvato di sodio, 2 mM di L-glutammina, 10 mM di HEPES e 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS). Evitare gli antibiotici nel terreno di coltura cellulare quando si lavora con l'infezione da Mtb.
2. Terreno RPMI senza siero: Integrare RPMI 1640 con 1 mM di piruvato di sodio, 2 mM di L-glutammina e 10 mM di HEPES.

2. Isolamento di cellule mononucleate nel sangue periferico da buffy coat

NOTA: Esegui tutto il lavoro con sangue umano (potenzialmente contagioso) all'interno di una cabina di biosicurezza di classe II. Inattivare i prodotti sanguigni residui con disinfettanti per 15 minuti prima di scartarli. In questo caso, il sangue è stato ottenuto da volontari sani. Questo protocollo di differenziazione dei macrofagi in vitro è stato impostato per includere 10 x 10⁶ PBMC isolate/donatore/pozzetto. Da ogni donatore, un buffy coat contiene circa 50 mL di una sospensione leucocitaria concentrata originata da sangue intero, che normalmente fornisce 500-800 x 10⁶ PBMC da cui è possibile recuperare circa il 10% o 50-80 x 10⁶ monociti.

1. Caricare 15 mL di sangue buffy-coat sopra 15 mL di terreno a gradiente di densità preparato in una provetta da 50 mL. Sovrapporre lentamente il sangue sopra lo strato del gradiente di densità appoggiando la punta della pipetta alla parete della provetta.
2. Centrifugare i tubi a 600 x g per 25 minuti a temperatura ambiente (RT) con 0 accelerazione e 0 decelerazione.
   nota: Chiudere accuratamente i coperchi prima della centrifugazione e controllare sempre che i supporti delle provette non presentino potenziali fuoriuscite dopo la centrifugazione.
3. Rimuovere lo strato superiore di plasma con una pipetta Pasteur sterile e successivamente raccogliere con cura lo strato di cellule mononucleate in una nuova provetta da 50 ml utilizzando una pipetta Pasteur sterile. Aggiungere il terreno RPMI senza siero al pellet PBMC per ottenere un volume finale di 50 mL. Mescolare accuratamente capovolgendo la provetta alcune volte prima della centrifugazione a 500 x g per 5 minuti a RT.
4. Scartare con cura il surnatante e risospendere il pellet cellulare capovolgendo il fondo del tubo all'interno delle dita.
5. Per rimuovere la contaminazione del mezzo a gradiente di densità dalle PBMC, lavare le cellule 2-3 volte con RPMI senza siero per ottenere un volume finale di 50 mL. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a RT. Lavare fino a quando il surnatante cellulare diventa trasparente.
6. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 20 mL di terreno RPMI privo di siero.
7. Contare le cellule mediante colorazione con blu di tripano, manualmente utilizzando un emocitometro o utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Diluire la sospensione cellulare in blu di tripano in diluizione 1:2 o 1:10 mescolando il campione di blu di tripano in una piastra a 96 pozzetti, ad esempio 50 μL + 50 μL (per il conteggio dell'emocitometro) o 10 μL + 10 μL (per il conteggio automatico delle cellule) e contare le cellule per ottenere il numero di cellule vive/mL.
   cautela: Il blu di tripano è tossico e deve essere gettato in un rifiuto chimico separato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lymphoprep	Alere Technologies AS	11508545
RPMI 1640	Società di tecnologie per la vita	SH30096.01
EDTA (0,5 m)	Ospedale universitario Karolinska, Huddinge	N/A
Na-piruvato	GE Healthcare Scienze della vita	SH300239.01
L-Glutammina	GE Healthcare Scienze della vita	SH30034.01
HEPES	GE Healthcare Scienze della vita	SH30237.01
Siero fetale bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524