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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Differenziazione e polarizzazione di cellule derivate da monociti
- Utilizzare l'aderenza plastica per l'isolamento dei monociti. In breve, seminare cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) appena isolate in una piastra di coltura a 6 pozzetti a una concentrazione appropriata, ad esempio 10 x 106 PBMC/pozzetto in 2 mL di terreno RPMI privo di siero (Integrare RPMI 1640 con 1 mM di piruvato di sodio, 2 mM di L-glutammina e 10 mM di HEPES) e incubare a 37 °C e 5% di CO2.
- Dopo 2-3 ore, rimuovere le cellule non aderenti con una pipetta e lavare i pozzetti 3 volte con 1 mL di terreno privo di siero. Le cellule attaccate sono monociti e comprendono circa il 10% del totale delle PBMC aggiunte al pozzetto, cioè 106 monociti recuperati da 10 x 106 PBMC aggiunti per pozzetto.
- Per la differenziazione dei macrofagi, preparare una soluzione di lavoro contenente 50 ng/mL GM-CSF o M-CSF rispettivamente per la polarizzazione dei macrofagi M1 e M2, aggiunti in 2 mL di terreno completo RPMI per pozzetto. Coltura delle cellule in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C per 3 giorni.
- Il giorno 3, rimuovere con cura 1 mL di terreno di coltura cellulare dallo strato superiore di ciascun pozzetto e integrare le colture cellulari con 1 mL di terreno completo RPMI fresco contenente la doppia concentrazione di M-CSF o GM-CSF per ottenere una concentrazione finale di 50 ng/mL nei pozzetti. Aggiungete i fattori di crescita in una soluzione di lavoro preconfezionata di 100 ng/mL/pozzetto.
- Il giorno 6, aggiungere diversi stimoli per le ultime 18-20 ore di differenziazione cellulare per ottenere M1 completamente polarizzato e maturo (interferone-γ; IFN-γ e lipopolisaccaride; LPS (E. coli O55:B5)) o M2 (interleuchina 4; IL-4). Per la polarizzazione M1, preparare IFN-γ e LPS in terreno completo RPMI (integrare RPMI 1640 con 1 mM di piruvato di sodio, 2 mM di L-glutammina, 10 mM di HEPES e 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS)) e aggiungere 50 μL per pozzetto per ottenere una concentrazione finale di 50 ng/mL di IFN-γ e 10 ng/mL di LPS nelle colture cellulari. Per la polarizzazione M2, preparare IL-4 in terreno completo RPMI e aggiungere 50 μL per pozzetto per ottenere una concentrazione finale di 20 ng/mL nelle colture cellulari.
- Per la differenziazione dei macrofagi polarizzati M0, stimolare le cellule solo con M-CSF, senza citochine aggiuntive (fornendo un fenotipo M2-simile).
- Controllare regolarmente la morfologia delle colture cellulari derivate da monociti con la microscopia ottica per garantire che i monociti più piccoli siano differenziati in cellule macrofagiche più grandi. Inoltre, monitorare le potenziali differenze morfologiche tra la polarizzazione M1 e M2, ovvero le cellule M1 allungate e allungate rispetto alle cellule M2 con una forma più arrotondata.