Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione delle celle di alimentazione AC-6
Nota: La linea cellulare stromale AC-6.21 (AC-6 in breve) (fornita da I. Weissman, Stanford University) dovrebbe essere mantenuta in RPMI integrata con il 15% di siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS). Per fungere da cellule nutrici, le cellule AC-6 vengono irradiate γ con 3.000 rad (30Gy) un giorno prima della co-coltura per prevenirne la proliferazione. Si noti che le cellule AC-6 tendono a perdere la loro capacità di supporto alla differenziazione se lasciate sovraffollate durante il mantenimento, o se il loro numero di passaggi è superiore a 20.
- Lavare una volta le cellule AC-6 con 1 ml di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) e rimuovere la DPBS mediante aspirazione. Trattare le cellule AC-6 con 0,8 ml di soluzione di tripsina (0,05% di tripsina e 0,5 mM di EDTA in DPBS) per 3-5 minuti a 37oC, 5% di CO2 e quindi interrompere la reazione diluendola con 10 volumi di terreno di coltura per ottenere una sospensione di una singola cellula.
- Seminare cellule AC-6 a 5,9x104 cellule/pozzetto in piastre a 12 pozzetti e incubarle a 37oC, 5% CO2 O/N.
nota: La densità delle celle AC-6 è molto importante in quanto una densità inferiore favorirà la generazione di cDC. La semina a una densità di 5,9x104 cellule/pozzetto consentirà ad AC-6 di raggiungere la confluenza entro il giorno successivo, il che è ottimale per la derivazione di pDC da CLP.
- Irradiare le celle AC-6 a 3.000 rad (30 Gy) utilizzando γ-irradiator.
Nota: La dose utilizzata per irradiare AC-6 è ottimizzata per prevenire la proliferazione delle cellule e mantenerle vitali abbastanza a lungo da fornire le citochine e il contatto cellula-cellula necessari per la differenziazione delle DC dai CLP.
- Aspirare il terreno e sostituirlo con 1 ml di RPMI completo (RPMI con il 10% di FBS inattivato termicamente, 50 μg/ml di gentamicina e 50 μM di β-mercaptoetanolo).
2. Isolare le cellule BM dai topi
- Sacrificare i topi per asfissia da CO2 e lussazione cervicale. Metti i topi su un vassoio di dissezione e sterilizzali con etanolo al 70%. Praticare un'incisione a metà dell'addome e rimuovere la pelle dalla parte distale del topo, compresa la pelle che copre gli arti inferiori.
- Sezionare i topi in un cappuccio semi-sterile. Per rilasciare il femore e le tibie, agganciare il femore sopra e le tibie sotto l'articolazione del ginocchio. Staccare i muscoli dalle ossa usando le forbici e posizionare le ossa in una capsula di Petri da 6 cm contenente 5 ml di RPMI completo.
- Passare a una cappa di coltura sterile. Riempire una siringa da 3 ml collegata a un ago da 27 G con RPMI completo. Tagliare entrambe le estremità delle ossa usando le forbici e inserire l'ago da 27G per espellere il midollo dalle ossa iniettando delicatamente l'RPMI completo una volta da ciascuna estremità.
- Preparare una sospensione unicellulare pipettando delicatamente le cellule verso l'alto e verso il basso 3-5 volte nel piatto di coltura utilizzando la siringa senza ago.
- Centrifugare le cellule per 5 minuti a 500 x g e decantare il surnatante.
- Lisi i globuli rossi con 1 ml di tampone ACK (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) incubando per 1 minuto e interrompendo la reazione diluendo con 10 volumi di RPMI completo. Lasciare riposare le cellule per 5 minuti per eliminare i grumi di cellule morte e i detriti di tessuto per gravità.
nota: Non riposare per più di 5 minuti poiché ciò comporterebbe la perdita di cellule a causa della sedimentazione di cellule vitali.
- Decantare lentamente il surnatante contenente cellule in una nuova provetta, lasciando i detriti nella provetta originale.
- Centrifugare per 5 minuti a 500 x g per pellettare le cellule, quindi rimuovere e scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule midollari totali (in genere 4-6 x 10;7 cellule midollari sono ottenute da un topo) in 100 μl di tampone FACS (1x PBS+ 2% FBS+ 1mM EDTA).
3. Analisi FACS e ordinamento dei CLP
- Aggiungere anti-CD16/32 (clone supernante dell'ibridoma 2.4G2, 50 μl/reazione o 1-2 μg/reazione) nelle cellule in tampone FACS (passo 2.9) per 1-2 minuti al fine di bloccare i recettori Fc.
nota: L'anti-CD16/32 è anche chiamato blocco Fc, che viene aggiunto per prevenire il legame non specifico degli anticorpi alle cellule che esprimono i recettori Fc, inclusi granulociti, monociti e linfociti B.
- Colorare contemporaneamente le cellule con i seguenti anticorpi marcati con colorante fluorescente (per 4x107 cellule) per 15 minuti su ghiaccio, evitando la luce ambientale. Anticorpi: marcatori di lignaggio coniugati con PE (0.0.) 2 μg ciascuno) inclusi anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6.7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1/70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti-Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119) e anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 μg anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 μg anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 μg anti-M-CSFR-APC (AFS98) e 0,2 μg anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
- Lavare le celle con 3 ml di tampone FACS e centrifugare per 5 minuti a 500 x g.
- Risospendere le cellule in un tampone FACS da 300 μl e filtrare le celle attraverso un filtro cellulare da 40 μM.
- Lavare la provetta con un ulteriore tampone FACS da 100 μl per recuperare le cellule rimanenti e filtrare in una provetta di smistamento FACS sterile utilizzando lo stesso filtro cellulare.
- Eseguire l'analisi citofluorimetrica immediatamente dopo la colorazione utilizzando filtri e tensioni appropriati per il rilevamento del segnale. Utilizzare un laser a 488 nm per rilevare gli anticorpi marcati con FITC, PerCP-Cy5.5, un laser a 561 nm per rilevare gli anticorpi marcati con PE e PE-Cy7 e un laser a 633 nm per rilevare l'anticorpo marcato con APC.
- Ordinare i CLP in base ai seguenti marcatori: lin-c-kit intSca-1intM-CSFR-IL-7Rα+ (come colorato al punto 3.2) utilizzando un selezionatore di cellule. Raccogliere le cellule selezionate in una provetta da 15 ml contenente 8 ml di RPMI completo come cuscino.
- Registra il numero assoluto di celle ordinate come mostrato dall'ordinatore di celle alla fine dell'esecuzione. In genere, 5x104 CLP possono essere ottenuti dal BM di un topo.
4. CLP di cocoltura e AC-6
- Centrifugare le cellule selezionate dal passaggio 3.7 per 10 minuti a 500 x g, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare con una quantità sufficiente di RPMI completo per ottenere una densità cellulare di circa 5x104 cellule/ml. Seminare 500 cellule/pozzetto nella piastra a 12 pozzetti contenente le cellule di alimentazione preparate al punto 1.4.
- Aggiungere 100 ng/ml di FL (hu-Flt3L-Ig generato internamente utilizzando un sistema di espressione fornito da M. Manz, Ospedale Universitario di Zurigo, Svizzera) e incubare a 37oC, 5% di CO2 con monitoraggio visivo periodico dello sviluppo delle DC al microscopio.
nota: La FL umana ricombinante o la FL di topo disponibili in commercio possono essere utilizzate come sostituto di hu-Flt3L-Ig per supportare lo sviluppo di DC.
- Raccogliere le cellule nel surnatante il giorno 12 e lavare i pozzetti una volta con 0,5 ml di terreno RPMI completo combinando i surnatanti risultanti. Aggiungere 0,5 ml di terreno fresco e raschiare le cellule aderenti con un raschietto cellulare.
- Combinare il terreno contenente cellule di entrambe le parti e centrifugare per 5 minuti a 500 x g.
- Decantare il surnatante e risospendere le cellule in un tampone FACS da 50 μl. Aggiungere 50 μl di surnatante di ibridoma anti-CD16/32 e incubare per 1-2 minuti per bloccare i recettori Fc.
- Enumerare e colorare tutte le cellule con i seguenti anticorpi (0,05 μg ciascuno) anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC e anti-B220-PE.
- Lavare e centrifugare le celle come descritto al punto 3.3.
- Risospendere le cellule in tampone FACS da 100 μl, eseguire il gate su CD11c+ e analizzare la presenza di cDC (CD11c+CD11b+B220-) e pDC (CD11c+CD11b-B220+).