Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)
- Preparazione del reagente
- Preparare PBS/EDTA: soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e integrare con acido etilendiamminotetraacetico 2 mM (EDTA). Sterilizzare questa soluzione mediante filtrazione attraverso un filtro da 0,2 μm. NOTA Conservare PBS/EDTA a 4 °C e riscaldarlo a temperatura ambiente prima dell'uso.
- Preparare il tampone di colorazione: integratore di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con siero bovino fetale al 2% (FBS), 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES) e 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Sterilizzare questa soluzione mediante filtrazione attraverso un filtro da 0,2 μm.
- Raccogli il sangue da Blood Cone
nota: Il cono di sangue contiene componenti di globuli bianchi raccolti dopo la piastrinoferesi dall'ospedale. Se il sangue viene raccolto in provette di eparina o EDTA, diluire il sangue con PBS in un rapporto 1:1 e procedere al passaggio 1.3; se si riceve un buffy coat, diluirlo con PBS in un rapporto 1:2 e procedere al passaggio 1.3.
- Tagliare le due estremità del cono per consentire al sangue di defluire in una provetta da 50 ml.
Si noti che il cono di solito contiene 10 ml di sangue.
- Utilizzare una siringa smussata contenente 30 ml di PBS/EDTA per lavare il cono e raccoglierlo in una provetta da 50 ml.
- Diluire ulteriormente il sangue con PBS/EDTA fino a un volume finale di 80 ml.
- Isolamento di PBMC mediante centrifugazione per densità
- Aliquotare 15 ml di Ficoll ciascuno in 4 tubi freschi da 50 ml.
- Utilizzare una pipetta sierologica da 25 ml per aggiungere 20 ml di sangue diluito sullo strato di Ficoll. Prendere nota di tenere il tubo da 50 ml a un angolo di 45 e fare attenzione a non disturbare l'interfase.
- Centrifugare le provette a 805 x g senza freni per 30 min, 20 °C.
- Rimuovere lo strato di plasma e raccogliere l'anello di PBMC che si trova appena sotto lo strato di plasma con una pipetta Pasteur. Combina quattro provette di PBMC in due provette da 50 ml. Si noti di evitare di raccogliere lo strato trasparente sotto le PBMC.
- Aggiungere PBS/EDTA a un volume finale di 50 ml per provetta di PBMC e centrifugare a 548 x g con freni per 10 min, 20 °C.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in ciascuna provetta con 25 ml di tampone colorante e unire in una provetta da 50 ml.
- Centrifugare a 367 x g con freni per 5 min, 4 °C.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet con 10 ml di tampone colorante.
2. Arricchimento dei monociti mediante separazione magnetica
- Determina il numero di cella
- Prelevare 20 μl di sospensione cellulare PBMC e mescolarla con 20 μl di blu di tripano per contare il numero di cellule vive utilizzando un citometro.
- Sospensione della cella centrifuga a 367 x g con freni per 10 min, 4 °C.
- Aspirare completamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare a una concentrazione di 10-7 cellule per 80 μl di tampone di colorazione.
- Etichettatura magnetica
- Aggiungere 20 μl di microsfere CD14 per 107 cellule, mescolare bene e incubare per 15 minuti a 2 - 8 °C.
- Lavare le celle aggiungendo 1 ml di tampone di colorazione per 10-7 celle e centrifugare a 367 x g con freni per 10 min, 4 °C.
- Aspirare completamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare in una concentrazione di 10-7 cellule per 50 μl di tampone di colorazione.
- Separazione magnetica
- Utilizzare una colonna di medie dimensioni per un massimo di 2 x 108 celle totali.
nota: Scegliere una colonna e un separatore appropriati in base al numero totale di celle e al numero di cellule CD14+ consigliate nella scheda tecnica.
- Posizionare la colonna nel campo magnetico di un separatore adatto e preparare la colonna risciacquandola con 500 μl di tampone colorante.
- Pipettare la sospensione cellulare sulla colonna e raccogliere le cellule non marcate che passano attraverso la colonna con una provetta da 15 ml.
- Riposizionare una nuova provetta da 15 ml sotto la colonna e lavare la colonna 3 volte con 500 μl di tampone colorante. Assicurarsi che il serbatoio della colonna sia vuoto prima di aggiungere un nuovo tampone di colorazione tra un lavaggio e l'altro.
- Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla su una provetta fresca da 15 ml.
- Pipettare 1 ml di tampone di colorazione sulla colonna. Sciacquare immediatamente le celle marcate magneticamente spingendo con decisione lo stantuffo (fornito nel kit) nella colonna.
- Ripetere i passaggi da 2.3.2 a 2.3.6 utilizzando la frazione eluita su una nuova colonna per aumentare la purezza delle cellule CD14+. Si noti che le perle verranno rilasciate automaticamente dalle cellule durante la coltura durante la fase 3.2.
3. Differenziazione delle cellule dendritiche in diversi stati di attivazione
- Preparazione del reagente (il livello di endotossine deve essere inferiore a 0,1 EU/ml in tutti i reagenti)
- Preparare il terreno di coltura cellulare: RPMI 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), l'1% di aminoacidi non essenziali (NEAA) e 0,05 mM di 2-mercaptoetanolo (2ME). Sterilizzare questa soluzione mediante filtrazione attraverso un filtro da 0,2 μm.
- Preparare citochine: ricostituire IL-4 e GM-CSF in acqua di coltura cellulare a una concentrazione di 0,25 mg/ml rispettivamente in condizioni asettiche. Aliquotare le citochine in provette da microcentrifuga da 200 μl e conservarle a -80 °C.
- Preparare il brodo di vitamina D3: ricostituire la vitamina D3 in acqua di coltura cellulare a una concentrazione di 100 mM in condizioni asettiche. Aliquotare la vitamina D3 in provette da microcentrifuga da 1,5 ml e conservare a -20 °C.
- Preparare il desametasone: ricostituire il desametasone in acqua di coltura cellulare a una concentrazione di 10 mM in condizioni asettiche. Aliquotare il desametasone in provette da microcentrifuga da 1,5 ml e conservare a -20 °C.
- Preparare l'LPS: ricostituire i lipopolisaccaridi (LPS) in acqua di coltura cellulare a una concentrazione di 1 mg/ml in condizioni asettiche. Aliquotare LPS in provette per microcentrifuga da 1,5 ml e conservare a -20 °C.
- Generazione di diversi moDC
- Seminare 4 serie di monociti CD14+ alla concentrazione di 0,3 - 0,5 x 106/ml di terreno di coltura cellulare integrato con 200 ng/ml di GM-CSF e 200 ng/ml di IL-4 in piastre a 6 pozzetti. Si noti che questo è il giorno 0 e il volume del terreno in ogni 6 pozzetti è di 2 ml.
- Incubare le cellule in un incubatore per colture tissutali a 37 °C con CO2 al 5%.
- Prelevare 850 μl di terreno dalla coltura al giorno 4 e centrifugare a 300 x g per 5 min, 4 °C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di terreno di coltura cellulare contenente 2x (200 ng/ml di GM-CSF e 200 ng/ml di IL-4). Aggiungere nuovamente questa miscela di cellule alla coltura. Si noti che la concentrazione 2x aggiunta per GM-CSF e IL-4 diventerà 1x quando 1 ml di terreno viene aggiunto nuovamente alla coltura.
- Aggiungere 1 μl di brodo di vitamina D3 e 1 μl di brodo di desametasone per ml di terreno a due delle serie il giorno 5 per generare moDC tollerogeniche. Si noti che la concentrazione finale di vitamina D3 è di 100 nM e il desametasone è di 10 nM; l'aggiunta di GM-CSF e IL-4 non è richiesta il giorno 5.
- Aggiungere 200 ng/ml di GM-CSF e 200 ng/ml di IL-4 a tutte le serie il giorno 6.
- Aggiungere 1 μg/ml di LPS a uno dei set trattati solo con GM-CSF e IL-4 al giorno 6 per generare moDC mature.
- Aggiungere 1 μg/ml di LPS a un set di moDC tollerogeniche il giorno 6 per generare moDC LPS-tolerogeniche.
- Raccogli i diversi tipi di moDC il giorno 7 lavando il piatto di coltura con PBS, EDTA per citometria a flusso o altri studi. Si noti che vengono raccolte solo le cellule non aderenti. Si noti che la resa percentuale dei monociti CD14+ per moDC immaturi, moDC maturi, moDC tollerogeniche e DC LPS-tolerogeniche è rispettivamente di circa il 90%, 50%, 60% e 60% e varia tra donatori di sangue e lotto FBS.
