Isolamento e purificazione di cellule B da sangue periferico umano

Abstract

Fonte: Tzeng, S. J. L'isolamento, la differenziazione e la quantificazione delle cellule B che secernono anticorpi umani dal sangue: ELISpot come lettura funzionale dell'immunità umorale. (2016)

In questo video, dimostriamo l'isolamento delle cellule B dal sangue periferico umano utilizzando anticorpi biotinilati specifici per le cellule non B e microsfere magnetiche coniugate con streptavidina.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale

1. Isolamento e purificazione delle cellule B del sangue periferico umano

1. Aspirare ~ 10 ml di sangue dalla vena cubitale mediana (nella fossa cubitale anteriore al gomito) in una provetta da 15 ml contenente K₂EDTA (da 1,5 a 2,0 mg/ml di sangue) e capovolgere immediatamente la provetta più volte per prevenire la formazione di coaguli.
2. Aggiungere 35 mL di tampone per lisi dei globuli rossi (RBC) autoclavato (121 °C, 15 min) (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ e 1 mM EDTA; pH 7,4) alla provetta contenente il campione di sangue fresco (≥ 3:1 vol/vol) e incubare a temperatura ambiente (RT) per non più di 5 min.
   nota: La comparsa della trasmissione della luce attraverso il tubo indica il completamento della lisi dei globuli rossi.
3. Centrifugare a 600 x g a RT per 5 min. Assicurarsi che il pellet sia di colore bianco.
4. Risospendere il pellet con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato autoclavato (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄ e 1,47 mM KH₂PO₄; pH 7,4) e centrifugare come al punto 1.3.
5. Scartare il surnatante, risospendere il pellet con 10 mL di terreno RPMI 1640 (integratori: 10% di siero fetale di vitello, 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 0,25 μg/mL di amfotericina B e 2 mM di L-glutammina), quindi piastrare le cellule in una piastra di coltura di 10 cm (10 mL di sangue per piastra). Mettere la capsula in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO₂ per 30 minuti.
6. Agitare delicatamente il piatto di coltura alcune volte e posizionare il terreno di coltura (cellule in sospensione) in provette coniche di plastica da 15 ml. Scartare le cellule aderenti (per lo più macrofagi) sui piatti di coltura.
7. Centrifugare a 600 x g a RT per 5 min. Scartare il surnatante.
8. Risospendere il pellet con 1 mL di terreno RPMI 1640. Contare il numero di cellule con un emocitometro o un contatore automatico di cellule.
   nota: La vitalità dei leucociti isolati è normalmente superiore al 90% per esclusione del blu di tripano.
9. Centrifugare come al punto 1.7 e risospendere le cellule in ~ 200 μL di tampone PBS freddo (0,5% albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM EDTA) alla concentrazione di 5 - 10 x 10⁶ cellule/mL.
10. Aggiungere 5 μL di cocktail di anticorpi umani biotinilati specifici per le cellule del sangue (per la selezione negativa delle cellule B) per 10-6 cellule e incubare su ghiaccio per 30 min.
    nota: Il cocktail anti-Ab umano dovrebbe includere almeno Abs specifici per CD2 (o CD3), CD14 e CD16.
11. Aggiungere un volume in eccesso di 10 volte di PBS sterile alle cellule, centrifugare a 600 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
12. Aggiungere quantità uguali di microsfere coniugate con streptavidina (5 μl per 10-6 cellule) al pellet e mescolare accuratamente.
13. Incubare con ghiaccio per 30 minuti in una provetta conica di plastica da 15 mL.
14. Aggiungere 2 mL di tampone PBS nella provetta.
15. Posizionare la provetta in un supporto magnetico e incubare a RT per 8 minuti. Le microsfere marroni si attaccheranno gradualmente alla parete del tubo accanto al magnete.
16. Con la provetta rimasta nel supporto magnetico, trasferire con cura il surnatante in una nuova provetta sterile da 15 ml.
17. Ripetere i passaggi da 1.14 a 1.16 e combinare i due surnatanti che contengono le cellule B intatte. Scartare le microsfere.
18. Centrifugare a 600 x g a RT per 5 min. Scartare il surnatante.
19. Risospendere il pellet nel mezzo RPMI 1640 per esperimenti a valle.
    nota: Tipicamente, è possibile isolare da 1 - 5 x 10⁵ cellule B con una purezza superiore al 95% da 10 mL di sangue periferico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BD Vacutainer K2E	BD Bioscienze	367525	Tubo da 10 ml
Ficoll-Paque Plus	GE Sanità	Codice 17-1440-02	Senza endotossine
Soluzione di blu di tripano 0,5%	Industrie Biologiche	03-102-1B	tingere
Set per l'arricchimento dei linfociti B umani IMag	BD Bioscienze	558007	Reagente
Microsfere magnetiche di streptavidina	BD Bioscienze	9000810	Reagente
Tubi Falcon da 15 ml	Falco BD	352196	Articoli in plastica
mAb biotinilato CD27	Bioleggenda	302804	Clone O323
Biotinilato anti-umano CD27	Bioleggenda	302804	Clone O323
Biotinilato anti-umano CD27	eBioscience	Codice 13-0279-80	Clone O323