Smistamento cellulare basato sulla citometria a flusso per diverse popolazioni di cellule B circolatorie

Abstract

Fonte: Tzeng, S. J. L'isolamento, la differenziazione e la quantificazione delle cellule B che secernono anticorpi umani dal sangue: ELISpot come lettura funzionale dell'immunità umorale. J. Vis. Exp. (2016).

In questo video, descriviamo un protocollo per lo smistamento basato sulla citometria a flusso di sottopopolazioni di cellule B naive, cellule B di memoria e plasmablasti da cellule B del sangue periferico umano. Le diverse sottopopolazioni di cellule B possono essere distinte in base al legame degli anticorpi basati su fluorofori ai recettori CD19, CD27 e CD38 espressi sulla superficie delle cellule B, seguito dallo smistamento cellulare.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Smistamento delle cellule per la raccolta di cellule B naive, cellule B di memoria e plasmablasti/plasmacellule (PB/PC)

1. Utilizzando cellule B purificate del sangue periferico umano, determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule.
2. Risospendere le cellule in tampone PBS freddo alla concentrazione di 10,7 per mL in una provetta di polistirene da 5 mL.
3. Aggiungere 1 - 2 μg di IgG umane per 10⁶ cellule e incubare su ghiaccio per 10 minuti per il blocco Fc.
4. Aggiungere 1 μg ciascuno di anti-CD19-APC (clone: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clone: O323) e anti-CD38-PE (clone: HIT2) per 10-6 cellule; mescolare bene e incubare con ghiaccio per 30 minuti.
5. Negli ultimi 5 minuti al passaggio 1.4, aggiungere 5 μL della 7-amminomicina D commerciale (7-AAD).
6. Aggiungere 2 mL di PBS alla provetta, agitare e centrifugare a 600 x g per 5 minuti.
7. Risospendere le cellule nel tampone di selezione (PBS sterile con 2% BSA e 2 mM EDTA) a una concentrazione di 1 - 5 x 10⁷ cellule per mL in una provetta da 15 mL.
8. Filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare a rete di nylon (dimensione dei pori di 40 μm) per eliminare i grumi cellulari.
9. Separare le cellule con un selezionatore citofluorimetrico dotato di tre laser: viola (405 nm), blu (488 nm) e rosso (640 nm).
   NOTA: Il laser blu da solo è sufficiente per la citometria a flusso a 3 colori.
10. Suddividere le cellule in tre provette da 15 mL (contenenti 5 mL di terreno RPMI) per la raccolta simultanea di cellule B naive (CD19⁺CD27^-), cellule B di memoria (CD19⁺CD27⁺) e PB/PC (CD19⁺CD27^+/hiCD38⁺).
    nota: Le cellule B naive e di memoria selezionate possono essere ulteriormente coltivate.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette Falcon da 15 mL	Falco BD	352196
Filtro cellulare a rete in nylon blu, 40 μm	Falco BD	Codice 352340
CD19-APC anti-umano	Bioleggenda	302212	clone HIB19
Anti-umano CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	clone O323
Anti-umano CD38-PE-Cy7	Bioleggenda	303516	clone HIT2
Anti-umano CD38-PE-Cy7	BD Bioscienze	560677	clone HIT2
Anti-umano CD45-FITC	Bioleggenda	304006	clone HI30
Anti-umano CD45-FITC	BD Bioscienze	555482	clone HI30
Anti-topo/ratto/umano CD27- PerCP Cy5.5	Bioleggenda	124213	clone LG.3A10
Anti-umano CD27-PerCP Cy5.5	BD Bioscienze	Codice 65429	clone L128
Anti-umano CD19-FITC	Miltenyi Biotec	Codice 130-098-064	clone LT19
Anti-umano CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	clone LT19
Anti-umano CD20-FITC	BD Bioscienze	555622	clone 2H7
7-amminoattinomicina D (7-AAD)	BD Bioscienze	559925
IgG umane	Jackson ImmunoResearch	Codice 009-000-003