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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Smistamento delle cellule per la raccolta di cellule B naive, cellule B di memoria e plasmablasti/plasmacellule (PB/PC)
- Utilizzando cellule B purificate del sangue periferico umano, determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule.
- Risospendere le cellule in tampone PBS freddo alla concentrazione di 10,7 per mL in una provetta di polistirene da 5 mL.
- Aggiungere 1 - 2 μg di IgG umane per 106 cellule e incubare su ghiaccio per 10 minuti per il blocco Fc.
- Aggiungere 1 μg ciascuno di anti-CD19-APC (clone: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clone: O323) e anti-CD38-PE (clone: HIT2) per 10-6 cellule; mescolare bene e incubare con ghiaccio per 30 minuti.
- Negli ultimi 5 minuti al passaggio 1.4, aggiungere 5 μL della 7-amminomicina D commerciale (7-AAD).
- Aggiungere 2 mL di PBS alla provetta, agitare e centrifugare a 600 x g per 5 minuti.
- Risospendere le cellule nel tampone di selezione (PBS sterile con 2% BSA e 2 mM EDTA) a una concentrazione di 1 - 5 x 107 cellule per mL in una provetta da 15 mL.
- Filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare a rete di nylon (dimensione dei pori di 40 μm) per eliminare i grumi cellulari.
- Separare le cellule con un selezionatore citofluorimetrico dotato di tre laser: viola (405 nm), blu (488 nm) e rosso (640 nm).
NOTA: Il laser blu da solo è sufficiente per la citometria a flusso a 3 colori.
- Suddividere le cellule in tre provette da 15 mL (contenenti 5 mL di terreno RPMI) per la raccolta simultanea di cellule B naive (CD19+CD27-), cellule B di memoria (CD19+CD27+) e PB/PC (CD19+CD27+/hiCD38+).
nota: Le cellule B naive e di memoria selezionate possono essere ulteriormente coltivate.