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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione delle provette di raccolta
- Prepara i terreni di coltura BMSC integrando il α MEM (MEM α) con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina.
- Mettere 100 μl di terreno di coltura BMSC in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Di solito 3 ossa entrano in una singola provetta, quindi prepararsi di conseguenza.
- Tagliare le estremità dei puntali delle pipette da 200 μl in modo che entrino nelle provette da centrifuga. Inserire le punte all'interno delle provette e assicurarsi che i coperchi possano chiudersi prima di posizionare le provette sul ghiaccio.
nota: In alternativa, è possibile inserire provette per microcentrifuga da 0,75 mL con le estremità tagliate nella provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
2. Raccolta di ossa dai topi
- Eutanasia degli animali con CO2 seguita da lussazione cervicale e spruzzarli con etano>nota: Assicurarsi che vengano utilizzati animali dello stesso sesso e preferibilmente della stessa età. Utilizziamo abitualmente animali di età compresa tra 7 e 8 settimane. Si consiglia di raggruppare le cellule di almeno 3 animali per gruppo sperimentale per ottenere una popolazione cellulare più rappresentativa e riproducibile.
- Posiziona il topo soppresso sulla schiena su una tavola da dissezione. Usa il forcipe per creare una tenda di pelle sull'addome. Praticare una piccola incisione (circa 1 cm) utilizzando forbici da dissezione sterili. Staccare la pelle verso gli arti e i piedi dal taglio in modo da esporre il basso addome e le gambe.
- Tagliare sotto l'articolazione della caviglia per rimuovere il piede. Taglia lungo la cresta iliaca all'anca per separare la testa del femore dall'osso iliaco. Mentre il topo è ancora sulla schiena, fai un'incisione al centro dell'osso iliaco per separare le due ossa iliache.
- Utilizzando salviette prive di lanugine, rimuovere con cura il muscolo dai femori, dalle tibie e dalle ossa iliache.
nota: Tagliare il più possibile i tendini e i muscoli dall'osso rende la pulizia più veloce e più facile con le salviette prive di lanugine (ad esempio, le salviette Kim). Prestare attenzione quando si manipolano le ossa poiché tendono a rompersi facilmente e la loro fragilità può essere aumentata con alcuni genotipi.
- Una volta che tutti i campioni sono stati sezionati, posizionarli in PBS su ghiaccio e trasferirli in una cappa di coltura sterile per le restanti fasi di isolamento.
nota: Lavorare il più possibile in modo asettico ridurrà il potenziale di contaminazione nelle colture.
- Praticare piccoli tagli (da 1 a 2 mm circa) sia all'estremità prossimale che a quella distale delle ossa prima di posizionarle nelle punte sezionate all'interno delle provette da centrifuga.
nota: Assicurarsi di tagliare una quantità sufficiente in modo che il midollo possa essere centrifugato; Tuttavia, è necessario prestare attenzione per evitare di tagliare troppo poiché le popolazioni cellulari tendono a variare in base alla vicinanza all'interno dello spazio midollare.
- Centrifugare a 10.000 x g per 15 s a temperatura ambiente. Assicurarsi che tutto il midollo sia lavato e pellettato sul fondo della provetta da 1,5 mL mentre le ossa si trovano all'interno degli inserti (puntale per pipetta da 200 μL o provetta per microcentrifuga da 0,75 mL). Una volta raccolto tutto il midollo, rimuovere gli inserti con le ossa dalle provette di raccolta.
nota: Se tutto il midollo è stato lavato, le ossa appariranno bianche. Tuttavia, se il midollo rimane in alcune ossa, provare a tagliare di nuovo le estremità e centrifugare.
3. Sospensione cellulare
- Utilizzando un ago da 25 G, tirare lentamente i pellet cellulari su e giù per rompere i grumi e combinare tutti i campioni in un'unica provetta conica da 15 mL. Aggiungere 10 mL di terreno di coltura BMSC per 500 μL di campioni.
- Posizionare un filtro da 70 μm sopra una provetta conica da 50 mL e far passare la sospensione cellulare attraverso questo filtro per rimuovere eventuali frammenti ossei.
4. Placcatura e coltura di popolazioni miste di cellule di midollo osseo (BMC totali)
NOTA: Le cellule vengono coltivate a 37 °C in un incubatore con il 5% di CO2.
- Calcolare il numero di cellule e piastrle a 1,0 x 106 cellule/cm2 in terreni di coltura. Lasciare 72 ore di coltura mista affinché le cellule si attacchino.
nota: Si consiglia di diluire la sospensione cellulare 20 volte in terreno di coltura e di diluirla nuovamente in blu di tripano prima di contare le cellule utilizzando un emocitometro. Per i topi maschi C57Bl6/J di 7 settimane, produciamo abitualmente un numero di cellule di circa 50 x 106 cellule, ma l'età, il sesso e il ceppo possono influenzare notevolmente il numero di cellule.
nota: Una popolazione mista di cellule dovrebbe attaccarsi bene sul fondo della coltura.
- Dopo 72 ore, rimuovere il supporto e sostituirlo con un nuovo supporto. Continuate a cambiare i media a giorni alterni e verificate la confluenza. Quando le cellule raggiungono l'80-100% di confluenza, sono pronte per la differenziazione.
nota: Poiché questa coltura è mescolata sia con BMSC che con HSC, può essere utilizzata direttamente per l'osteoblastogenesi, l'adipogenesi e l'osteoclastogenesi.
5. Placcatura e cultura della popolazione divisa di BMSC (BMSC aderenti)
NOTA: Le cellule vengono coltivate a 37 °C in un incubatore con il 5% di CO2.
- Piastra tutte le cellule raccolte dai femori, dalle tibie e dalle ossa iliache di un topo in una piastra di coltura di 10 cm (55cm2 di area di coltura).
nota: Quando si raggruppano 2-3 topi C57BL/6J, in genere si piastra questa popolazione "totale" di midollo osseo in un pallone da 150 cm2.
- Dopo 48 ore di coltura mista, rimuovere il terreno di coltura (contenente le HSC non aderenti). Se si devono eseguire esperimenti di osteoclastogenesi, mettere da parte questa popolazione di cellule non aderenti, in caso contrario, aspirare e scartare queste cellule.
- Lavare accuratamente la piastra/matraccio con PBS in modo da non disturbare le celle attaccate.
- Rimuovere la PBS e sollevare le cellule aggiungendo lo 0,25% di tripsina e incubando a 37 °C per 1-3 minuti. Estinguere la tripsina aggiungendo terreno cellulare alla sospensione cellulare. A questo punto, le BMSC, che ora sono state sollevate, possono essere contate (come precedentemente fatto nel passaggio 4.1) e piastrate per esperimenti futuri.
- Calcola il numero di celle necessarie per la placcatura. Centrifugare il volume richiesto di sospensione cellulare a 1.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
nota: Le celle sono in genere piastrate in base a esperimenti end-point. Ad esempio, se la proteina/RNA deve essere isolata, in genere piastramo a una densità più elevata (~1,0-2,0 x 106 cellule/pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
- Rimuovere il terreno e risospendere il pellet di cella nel volume di terreno di coltura necessario per la piastra. Placcare le cellule in terreni di coltura secondo gli esperimenti e lasciarle attaccare per alcuni giorni. Quando le BMSC raggiungono la confluenza, procedere con la differenziazione.
6. Differenziazione delle BMSC
- Adipociti
- Preparare terreni di base adipocitaria mescolando insieme 90 ml di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose, 10 ml di siero fetale bovino, 1 ml di penicillina/streptomicina, 100 μl 20 mM di rosiglitazone e 100 μl di 2 mM di insulina. Se necessario, conservare questo terreno a 4 °C per la settimana durante l'esperimento di differenziazione.
- Preparare terreni di induzione degli adipociti aggiungendo 200 μL di 62,5 mM di 3-isobutile-1-metilxantina (IBMX) e 25 μL di 1 mM di Desametasone a 25 mL di terreno di base adipocitario.
- Una volta che le colture di BMSC (BMC totali della fase 4.3 o BMSC aderenti della fase 5.6) sono confluenti, cambiare il terreno in terreno di induzione degli adipociti. Considera questo Giorno 0 di differenziazione.
- Dopo 48 ore, rimuovere il terreno e rinfrescare la coltura con il terreno di induzione degli adipociti.
- Il giorno 4, passare a base adipocitaria media.
nota: Le goccioline lipidiche possono iniziare a comparire già dal giorno 2 o dal giorno 4.
- Il giorno 7, osservare che le cellule hanno accumulato il massimo delle goccioline lipidiche e mostrano un fenotipo simile a un adipocita maturo. Non eseguire la coltura oltre questo punto, poiché potrebbe provocare la morte/distacco cellulare.