Isolamento delle cellule T basato sulla flottazione mediante smistamento cellulare attivato dalla galleggiabilità

Abstract

Fonte: Snow, T., et al. Isolamento, attivazione ed espansione delle cellule T basate sulla flottazione da campioni di cellule mononucleate di sangue periferico umano utilizzando microbolle. (2022)

Questo video dimostra l'isolamento delle cellule T dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) utilizzando la tecnologia di selezione cellulare attivata da galleggiabilità funzionalizzata (BACS). La tecnica di isolamento prevede la selezione positiva delle cellule T CD3+ mediante marcatura delle cellule con anticorpi anti-CD3 biotinilati e separazione delle cellule legate agli anticorpi utilizzando microbolle legate alla streptavidina.

Protocollo

1. Isolamento di cellule T con microbolle utilizzando la selezione positiva

NOTA: Questo protocollo descrive in dettaglio un approccio di selezione positiva CD3⁺ su piccola scala utilizzando SAMB.

1. Incubare 3 x 10⁸ PBMC ottenute commercialmente in 2,5 mL di tampone di separazione con anticorpo biotinilato anti-CD3 (OKT3) a una concentrazione di 25 ng di anticorpi per 1 milione di cellule (25 ng/M). Mescolare delicatamente pipettando su e giù e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
2. Aggiungere microbolle di streptavidina (SAMB) in un rapporto di 0,5 (quantità SAMB):1 (quantità cellulare) in base alla concentrazione di SAMB riportata dal produttore.
3. Miscelare utilizzando un rotatore end-over-end (EOE) commerciale a 20 giri/min per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare per 5 min a 400 x g a temperatura ambiente.
4. Dopo la centrifugazione, le cellule selezionate positivamente saranno nella parte superiore della sospensione con i SAMB. Le restanti celle non selezionate saranno nel pellet di cella sul fondo del tubo. Utilizzando una pipetta di vetro da 9 pollici, inserire il puntale sotto lo strato di bolle sul fondo della provetta, aspirare il pellet cellulare e il surnatante con una pipetta elettronica e trasferirli in una nuova provetta.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpo anti-CD3 umano (OKT3) della biotina	Bioleggenda	Codice 317320
Leucopaco	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
PBMC umani normali	BioIVT	UMANOHLPB-0002562
Kit microbolle di streptavidina (include il tampone di separazione di Akadeum)	Akadeum	Codice 11110-000