Coltura di cellule T attivate da cellule mononucleate del sangue periferico umano

Abstract

Fonte: Mølgaard, K., et al. Monitoraggio in tempo reale della respirazione mitocondriale nelle cellule T primarie umane differenziate da citochine. J. Vis. Exp. (2021).

In questo video, descriviamo un protocollo per l'attivazione delle cellule T primarie umane. L'incubazione di cellule T naive con biglie magnetiche rivestite con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28, seguita da un trattamento con interleuchina-2 o interleuchina-15, porta all'attivazione di cellule T naive e alla loro differenziazione e proliferazione in cellule T effettrici o di memoria.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Coltura di linfociti T primari umani attivati

1. Scongelamento delle cellule (Giorno 1)
   1. Preriscaldare 10 mL di RPMI 1640 per campione a circa 37 °C.
   2. Prelevare il numero desiderato di fiale di cellule mononucleate del sangue periferico e conservarle temporaneamente su ghiaccio secco.
   3. Risospendere le cellule congelate in 10 mL di RPMI 1640 preriscaldato.
   4. Centrifugare le celle per 5 minuti a 500 x g a RT.
   5. Scartare il surnatante e lavare nuovamente le cellule risospendendole in 10 mL di RPMI 1640 e centrifugare come descritto al punto 1.1.4.
   6. Scartare il surnatante e risospendere le cellule a 2 x 10⁶ cellule per mL di terreno X-VIVO 15 + 5% di siero umano (di seguito: terreno a cellule T).
   7. Piastra 2 mL di cellule per pozzetto in una piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti e incubazione notturna a 37 °C e 5% di CO₂.
2. Attivazione delle cellule (Giorno 0)
   1. Lavare le microsfere CD3/CD28 trasferendo 12,5 μL di perle per 1 milione di cellule in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 12,5 μl di PBS per 12,5 μl di perline.
      nota: È importante agitare la fiala di perline prima dell'uso.
   2. Posizionare la provetta da microcentrifuga su un magnete adatto per 1 minuto.
   3. Scartare il tampone e risospendere le perle nel volume originale del terreno delle cellule T (12,5 μl di terreno delle cellule T per 12,5 μl del volume originale delle perle).
   4. Aggiungere 12,5 μl di perle per milione di cellule, corrispondenti a un rapporto di 1:2 (perline: cellule).
   5. Dividi le cellule in due condizioni con circa 5 milioni di cellule ciascuna.
   6. Aggiungere il volume corretto di citochine alle condizioni menzionate nella Tabella 1.
   7. Incubare le cellule per 3 giorni a 37 °C e 5% di CO₂.
3. Coltura delle cellule (Giorni 3 e 5)
   1. Risospendere le cellule e dividerle trasferendo metà del volume da ciascun pozzetto in un nuovo pozzetto. Aggiungere lo stesso volume di terreno di coltura delle cellule T fresche a ciascun pozzetto.
   2. Aggiungere nuove citochine a ciascuna condizione come indicato nella Tabella 1.

	Citochine	ceppo	Fattore di diluizione	finale
Condizione 1	IL-2	3 x 106 U/mL	30.000	100 U/mL
Condizione 2	IL-15	2 x 105 U/mL	2.000	100 U/mL

Tabella 1: Preparazione di colture di citochine utilizzate per guidare i cambiamenti metabolici nelle cellule T.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti	Nunc	142485
Perline anti-CD3xCD28	Gibco	Codice 11161D
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F
Siero Umano	Sigma Aldrich	H4522	Calore inattivato a 56 °C per 30 min
IL-15	Peprotech	200-02
IL-2	Peprotech	200-15
Lymphoprep	Tecnologie delle cellule staminali	Codice: 7801
Pbs	Thermo Fisher	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fisher	61870036
Magnete per perline a cellule T DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher	Codice 12321D