Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento di singole cellule da PDLN
- Posizionare una rete metallica sterile da 250 μm su una provetta conica da 15 mL in un rack. Sciacquare la rete con 1 mL di RPMI.
- Trasferisci i linfonodi sulla rete metallica e macinali attraverso la rete usando un paio di pinzette. Applicare 1 mL di RPMI sulla rete metallica per lavare le cellule nella provetta. Ripeti altre 3 volte e rimuovi la rete.
- Centrifugare le provette a 433 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in circa 5 mL di RPMI. Riempire i tubi con RPMI.
- Centrifugare le provette a 433 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in circa 5 mL di RPMI. Riempire i tubi con RPMI.
- Centrifugare le provette a 433 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di RPMI. Trasferire 2 mL della sospensione cellulare in provette a fondo tondo da 5 mL con cappucci per il filtro delle cellule. Applicare la sospensione cellulare sui cappucci del filtro cellulare.
2. Citometria a flusso
- Centrifugare le sospensioni cellulari da PDLN a 433 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
- Colorare le cellule con i seguenti anticorpi di superficie in 100 μL di tampone di colorazione per citometria a flusso (tampone FACS): 0,75 μg/100 μL di anticorpo CD4 coniugato con FITC, 0,60 μg/100 μL di anticorpo CD8 coniugato con APC-H7, 0,30 μg/100 μL di anticorpo CD25 coniugato con PE, 5 μL (1:20) di anticorpo Nrp1 coniugato con APC. Incubare le provette su ghiaccio per 40 minuti.
- Aggiungere 200 μl di tampone FACS a ciascuna provetta. Centrifugare le provette a 433 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante. Ripeti ancora una volta.
- Fissare e permeabilizzare le cellule risospendendo il pellet cellulare in 500 μL di tampone di fissazione della permeabilizzazione (PFB).
nota: Il PFB viene preparato mescolando 1 parte di concentrato di fissazione/permeabilizzazione con 3 parti di diluente di fissazione/permeabilizzazione.
- Conservare i tubi in frigorifero a 4 °C per una notte.
nota: Funziona anche un'incubazione di 1 ora.
- Centrifugare le provette a 433 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 500 μL di tampone di lavaggio per permeabilizzazione (PWB). Centrifugare le provette a 433 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
nota: Il PWB viene preparato diluendo il tampone di permeabilizzazione (10x) a 1:10 in acqua distillata.
- Colorare le cellule con i seguenti anticorpi intracellulari in 100 μL di PWB: 0,30 μg/100 μL di anticorpo Foxp3 coniugato PE-Cy7, 4 μL (1:25) di anticorpo Helios coniugato con PacificBlue. Incubare le provette su ghiaccio per 1 ora.
- Aggiungere 500 μl di PWB a ciascuna provetta. Centrifugare le provette a 433 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
- Risospendere il pellet della cella in 500 μL di PWB. Centrifugare le provette a 433 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
- Risospendere il pellet della cella in 300 μL di tampone FACS.
- Analizza le cellule su un citometro a flusso.
- Gate le singole celle in base all'area di dispersione laterale, all'altezza e alla larghezza e all'area di dispersione in avanti, all'altezza e alla larghezza. Esegui un milione di eventi per l'analisi.
- Esporta i file FCS degli esperimenti e analizzali utilizzando il software dell'analizzatore di citometria a flusso.
