Isolamento di leucociti epatici marginanti da un fegato di topo

Abstract

Fonte: Sorski, L., et al. Prelievo Selettivo di Leucociti Epatici Marginanti. J. Vis. Exp. (2016)

In questo video, dimostriamo l'isolamento dei leucociti epatici marginanti dal fegato di topo mediante perfusione forzata.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Protocollo del mouse

1. Perfusione epatica e raccolta di leucociti MH
   1. Sopprimere l'animale con un sovradosaggio di isoflurano all'8%. Per precauzione, posizionare un tubo da 15 ml contenente un tampone imbevuto di isoflurano intorno alla testa del topo fino ad aprire la cavità toracica.
   2. Fissa gli arti del topo a un letto.
   3. Aprire le cavità peritoneale e toracica per esporre il fegato e il complesso cardiopolmonare immediatamente dopo la cessazione della respirazione, mantenendo intatta la parte inferiore del diaframma (per creare una vasca di cavità toracica drenante). Evita il sanguinamento durante questo processo.
      1. In particolare, iniziare l'incisione dal punto della linea mediana addominale inferiore, senza danneggiare gli organi interni, e procedere su entrambi i lati in diagonale verso le costole, tagliandole fino ai livelli superiori della cavità toracica.
   4. Estrarre gli intestini e posizionarli all'esterno dell'animale alla destra dello sperimentatore, per esporre la vena porta.
   5. Inserire un ago da 30 g, collegato a una pompa peristaltica nella vena porta rostrale alla vena splenica.
   6. Tagliare la vena cava inferiore sopra il diaframma per consentire il drenaggio e la raccolta del perfusato dalla cavità toracica.
   7. Accendere la pompa peristaltica a una velocità di circa 3 ml/min e raccogliere delicatamente i primi 3 ml di perfusato contaminato da sangue dalla piscina della cavità toracica.
   8. Scartare questo perfusare. Ripetere nuovamente tale lavaggio, se necessario, utilizzando soluzione fisiologica, e solo allora iniziare a raccogliere il perfusato di fegato.
   9. Riavviare la perfusione a una velocità massima di 4 ml/min e raccogliere 10 ml di perfusato dalla cavità toracica utilizzando una farfalla collegata a una siringa.
   10. Termina la perfusione quando il colore del fegato diventa marrone chiaro.

2. Estrazione dei leucociti

1. Centrifugare il perfusato per 10 minuti a 400 x g.
2. Aspirare il surnatante.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pompa peristaltica Autoclud
Ago a farfalla	oh mio dio		26 grammi
Ago a farfalla	oh mio dio		21G * 3/4 "
siringa	Soluzione Pic		1 ml
siringa	Soluzione Pic		2,5 ml
siringa	Soluzione Pic		Flacone da 5 ml
siringa	Soluzione Pic		Confezione da 10 ml
siringa	Soluzione Pic		Confezione da 25 ml
Pinza a lama smussata
forbici
Emostatico
Pinze per tessuti