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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Differenziazione dei megacariociti
- Seminare 5 × 105 cellule/mL di cellule CD34+ in 2 mL di SFM integrati con 50 ng/mL di trombopoietina umana ricombinante (rhTPO) per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 in atmosfera umidificata. Se le cellule sono confluenti prima di essere necessarie per l'analisi, raccogliere le cellule e dividerle in più pozzetti con terreno fresco e rhTPO.
nota: Due o tre pozzetti dovrebbero essere preparati specificamente per monitorare la differenziazione in diversi punti temporali (ad esempio, giorni 7, 9 e 10).
- Raccogli le cellule dai pozzetti riservati per monitorare la differenziazione senza disturbare le cellule negli altri pozzetti.
- Colorare le cellule con 20 μL di anticorpo anti-GPIIb/CD41-FITC e 10 μL di anticorpo anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 in un volume finale di 100 μL. Impostare una provetta di controllo utilizzando i rispettivi anticorpi di controllo dell'isotipo. Incubare per 15 - 30 minuti a 4 °C.
- Aggiungere 1 ml di SB per lavare. Centrifugare a 400 × g per 10 min. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 200 - 300 μL di SB. Analizzare mediante citometria a flusso.
- Per ogni fluoroforo, analizza i controlli isotipici per impostare il gating per le popolazioni positive a FITC e Alexa Flour 647. Analizzare i campioni di cellule colorate per determinare la percentuale di cellule CD41+/CD42a+ doppie positive, che rappresentano MK mature (Figura 1C).
- Per la visualizzazione microscopica dei marcatori della superficie cellulare, colorare le cellule come descritto al punto 1.3.
- Aggiungere 1 ml di SB per lavare. Centrifugare a 400 × g per 10 min. Risospendere il pellet in 100 μl di SB e farlo girare su un vetrino a 1.000 x g per 5 minuti. Fissare le celle sul vetrino immergendole nel metanolo per 30 s. Asciugare all'aria, aggiungere 20 μl di terreno di montaggio contenente DAPI (vedere la Tabella dei materiali), coprire con un vetrino coprioggetti e visualizzare utilizzando un microscopio a fluorescenza (Figura 2A).
- Per la visualizzazione degli antigeni intracellulari, risospendere le cellule in PBS e fissarle con paraformaldeide (concentrazione finale all'1%) per 15 minuti a temperatura ambiente. Per permeabilizzare le cellule, aggiungere triton-X 100 (0,1%) e incubare per 15 minuti. Lavare le celle con 2 mL di PBS/0,1% di triton-X 100. Risospendere in 100 μl di PBS/0,1% triton-X 100, aggiungere anticorpi anti-vWf e anti-CD62p (diluizione 1:200) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare con 2 mL di PBS/0,1% di triton-X 100 e centrifugare a 400 × g per 10 min, risospendere in 100 μL dello stesso tampone e aggiungere IgG-Alexa 594 anti-topo e IgG-Alexa 488 anti-coniglio (1:100). Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, lavare con 2 mL di PBS/0,1% triton-X 100, risospendere in 100 μL dello stesso tampone e aggiungere 20 μL di anti-CD42b-APC. Quindi ruotare le cellule su vetrini come descritto al punto 1.6.1 e preparare i campioni per la visualizzazione microscopica come descritto al punto 1.6.1.
- Per la determinazione della ploidia, prelevare le cellule al giorno 12 o 13 di differenziazione. Aggiungere 1 ml di SB per lavare. Centrifugare a 400 × g per 10 min e colorare con 20 μL di anticorpo anti-GPIIb/CD41-FITC in un volume finale di 100 μL. Incubare a 4 °C per 30 min.
- Lavare una volta con 1 mL di SB e risospendere il pellet in 300 μL di tampone citrato ipotonico (1,25 mM di citrato di sodio, 2,5 mM di cloruro di sodio, 3,5 mM di destrosio) contenente 20 μg/ml di ioduro di propidio e 0,05% di Triton-X 100. Incubare per 15 minuti a 4 °C al riparo dalla luce.
- Aggiungere RNasi a una concentrazione finale di 20 μg/mL e incubare per 30 minuti a 4 °C al riparo dalla luce. Determinare l'intensità dello ioduro di propidio mediante citometria a flusso raccogliendo da 30.000 a 50.000 eventi della popolazione CD41-FITC+ (Figura 2C).
2. Conta delle propiastrine, enumerazione delle piastrine e attivazione delle piastrine
- Raccogliere le cellule (dalla fase 1.1) ai giorni 8 o 9 di differenziazione e seminare a 1 ×10 4 cellule/pozzetto in piastre a 48 pozzetti in 200 μL di SFM fresco integrato con 50 ng/mL di rhTPO. Coltura per 5 giorni a 37 °C, 5% CO2,
nota: Ai fini della quantificazione, i pozzetti del seme sono in triplice copia. Questa bassa densità è necessaria per la visualizzazione e il conteggio delle MK portatrici di propiastrine. Le propiastrine di solito iniziano a comparire dopo 2 giorni di coltura. Il picco è tra il 4° e il 5° giorno.
- Contare il numero di MK portatori di propiastrine nell'intero pozzetto su un microscopio a luce invertita utilizzando obiettivi 10X o 20X.
nota: È preferibile un tavolino da microscopio riscaldato (37 °C) poiché il mantenimento delle cellule a temperatura ambiente per periodi prolungati provoca il restringimento delle estensioni delle propiastrine. Le propiastrine sono osservate come lunghe estensioni dal corpo MK. Ogni MK può avere diverse protrusioni propiastriniche. Man mano che le propiastrine si sviluppano, il corpo del MK diminuisce di dimensioni.
- Raccogliere le celle e centrifugare a 400 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Colorare le cellule con 20 μL di anticorpo CD41-FITC umano, come descritto nei passaggi 1.3 e 1.4. Calcola la percentuale di MK portatore di propiastrine (pbMK):
pbMK (%) = [(MK portanti propiastrine/ pozzetto) / (Totale cellule CD41+/ pozzetto)] x 100
- Per contare le piastrine rilasciate nel terreno di coltura, mescolare delicatamente le cellule con una pipetta Pasteur e raccogliere 100 μl al giorno 14 o 15 di coltura.
- Colorare con 20 μL di anticorpo anti-umano CD41-FITC per 20 - 30 minuti a 4 °C. Impostare una provetta di controllo utilizzando il rispettivo anticorpo di controllo dell'isotipo.
- Aggiungere 150 μl di SB e 50 μl di microsfere di conteggio.
- Per l'analisi citofluorimetrica, impostare l'FSC e l'SSC sulla scala logaritmica. Utilizzare normali piastrine del sangue umano provenienti da plasma ricco di piastrine colorato con CD41-FITC come descritto nel paragrafo 2.4.1 per impostare il gating per le piastrine (Figura 3A).
- Analizzare le piastrine colorate contando le perle mediante citometria a flusso. Raccogli 1.000 eventi di conteggio delle perline utilizzando il grafico a dispersione FSC e SSC (Figura 3A). Calcolare il numero di piastrine in base agli eventi positivi CD41-FITC (Figura 3B) utilizzando la formula:
Piastrine per μL=[(numero di eventi positivi CD41-FITC)/1.000 sfere)] x [(numero di perle in 50 μL)/volume del campione)]
- Per analizzare l'attivazione piastrinica, mescolare delicatamente le cellule con una pipetta Pasteur e raccogliere 100 μL al giorno 14 o 15 di coltura. Aggiungere 1 mL di tampone di Tyrode (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5,5 mM D-glucosio, pH 6,5) e centrifugare a 200 x g per 5 min in celle a pellet.
- Raccogliere il surnatante e centrifugare a 800 x g per 10 minuti fino a pellettare particelle delle dimensioni di una piastrina.
- Scartare il surnatante e risospendere in 100 μL di tampone di Tyrode. Aggiungere 20 μl di anticorpo PAC1-FITC e adenosina difosfato (ADP) a una concentrazione finale di 20 μM. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Analizzare mediante citometria a flusso per determinare la percentuale di eventi positivi alla FITC. Utilizzare piastrine umane fresche trattate allo stesso modo di un controllo positivo (Figura 3C).
