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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. 3D Coltura di organi timici per generare iTE
- Prelevare i lobi del timo fetale di topo e distribuire i linfociti endogeni mediante trattamento con deossiguanosina (dGUO).
- Il 7° giorno di trattamento con dGUO, prendere quattro nuove piastre da 10 cm e riempire ciascuna con 20 ml di terreno completo (Roswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-alanil-L-glutammina + 1x piruvato di sodio + 1x terreno essenziale minimo con aminoacidi non essenziali (MEM-NEAA) + 1x penicillina-streptomicina + [1:1000] 2-mercapto etanolo).
- Trasferire tutte le membrane di nitrocellulosa con lobi timici in un piatto di 10 cm. Staccare i singoli lobi dalla membrana con una pinza, permettendo loro di essere immersi nel mezzo. Scartare le membrane. Incubare per 1 ora a RT.
- Trasferire i lobi timici in un nuovo piatto da 10 cm con terreno completo e incubare per 1 ora a RT. Ripetere questo passaggio altre 2 volte.
- Usando una pinza, fissa i lobi timici al piatto (uno alla volta) e con l'altra mano fai un'incisione profonda 100-200 μm al centro ed estendi metà del diametro del lobo per facilitare la migrazione dei progenitori delle cellule T nel lobo.
- Trasferire i lobi timici in un nuovo piatto di 10 cm riempito con terreno di differenziazione completo (terreno completo + 5 ng/mL di interleuchina-7 di topo (IL-7) + 5 ng/mL di ligando Flt3 di topo (FLT3L) + 5 ng/mL di fattore di cellule staminali (SCF)).
- Facoltativamente, se si utilizzano piastre di coltura 3D con griglie di livello inferiore e superiore, riempire entrambe le griglie con PBS sterile per evitare l'evaporazione e l'essiccazione delle gocce pendenti.
- Trasferire 30 μl di terreno completo contenente un lobo timico trattato con dGuo dalla fase 1.6 in ciascun pozzetto della piastra di coltura 3D.
- Raccogliere cellule di linea T non aderenti (cellule T immature derivate da iPSC) dalla co-coltura OP9/DLL1 (giorni 16-21) e risospendere a 2-5 x 10cellule di linea 3 T per 20 μL di terreno.
- Aggiungere 20 μl di sospensione di cellule del lignaggio T a ciascun lobo timico nella piastra di coltura 3D. Incubare per una notte a 37 °C con CO2 al 5%.
- Impostare la pipetta P200 a 30 μl e aspirare il terreno dopo averlo pipettato più volte da ciascun pozzetto per rimuovere tutte le cellule che circondano i lobi timici. Scartare il terreno e aggiungere 30 μL di terreno completo. Ripetere questa procedura 5-7 volte per rimuovere eventuali cellule T immature in eccesso che non migrano nei lobi. Successivamente sostituire 25-30 μl di terreno al giorno.
- Confermare la formazione di un alone di emigranti timici derivati da iPSC (iTE) attorno ai lobi a partire dai giorni 4-5 mediante microscopia ottica.
- Raccogliete iTE ogni giorno pipettando i terreni senza l'interruzione dei lobi. Cambia i supporti ogni giorno e continua la raccolta per un massimo di circa 12 giorni.
- Gli iTE raccolti sono pronti per l'uso per analisi molecolari (Figura 1, Figura 2, Figura 3 e Figura 4) o per esperimenti di trapianto in vivo.
