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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Espansione delle cellule NK dai tessuti epatici (Giorno 0), come mostrato nella Figura 1.
NOTA: Il numero iniziale di cellule e la vitalità sono fortemente correlati con il tempo trascorso dalla rimozione dell'organo e la quantità iniziale di campione di tessuto. Tuttavia, se i tessuti vengono posti in 30 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e conservati in ghiaccio o in frigorifero a 4 °C per una notte, le cellule NK possono ancora essere espanse ad alta purezza e vitalità fino a 24 ore dopo.
- Identificare le aree tissutali vitali per ottenere linfociti da tessuti e sezioni utilizzando apparecchiature chirurgiche sterili.
- Mettere i fazzoletti in 30 ml di HBSS (senza calcio o magnesio) e tenerli in ghiaccio fino al momento di prepararsi per l'isolamento.
- Tritare il tessuto in cubetti di <0,5 cm utilizzando lame di rasoio sterili o forbici e pinze all'interno di una cappa di biosicurezza.
- Preparare una soluzione 1x collagenasi IV (1 mg/mL) diluendo un stock 10x in HBSS (10x Collagenasi IV: 10 mg/mL o ~200 U/mL).
- Posizionare i pezzi di tessuto tritato nelle provette dissociatrici dei tessuti. Riempire le provette con non più di 4 g di tessuto e immergere i pezzi di tessuto in ~10 ml di 1x collagenasi IV.
nota: L'uso di DNasi I non è raccomandato in quanto potrebbe ridurre leggermente la vitalità e la resa di NK. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i tubi dissociatori tissutali specifici utilizzati.
- Posizionare le provette del dissociatore tissutale in un dissociatore tissutale e frullare a 37 °C per tritare accuratamente il tessuto.
nota: Per il tessuto epatico, questo può richiedere più di 30 minuti. Per un tessuto più friabile, possono essere sufficienti circa 15 minuti. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per le provette dissociatrici tissutali specifiche e per il dissociatore tissutale utilizzato.
- Rimuovere le provette del dissociatore tissutale e triturare attraverso un filtro cellulare in nylon da 40 μm utilizzando la parte posteriore di una siringa da 5 ml. Raccogli l'eluente e scarta i grandi frammenti non digeriti.
- Centrifugare l'eluente a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante.
- Risospendere i pellet cellulari in silice rivestita di polivinilpirrolidone (PVP) al 30% per rimuovere le cellule adipose che altrimenti contaminerebbero la frazione linfocitaria finale.
- Per preparare 1x silice rivestita in PVP, utilizzare una diluizione 9:1 di silice rivestita in PVP in 10x PBS.
nota: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per la silice rivestita in PVP specifica utilizzata.
- Per preparare il 30% di silice rivestita in PVP, diluire 1 silice rivestita in PVP con PBS/HBSS.
- Centrifugare il pellet della cella a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 9 mL di terreno R-10.
nota: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per la composizione dei mezzi R-10.
- Sovrapporre accuratamente la sospensione cellulare su 4 mL di terreno di separazione di Ficoll o linfociti per separare i linfociti dai globuli rossi e dalle cellule polimorfonucleate.
- Separare gli strati centrifugando a 400 x g per 23 minuti a temperatura ambiente con accelerazione e freni disinseriti o al minimo. Decantare accuratamente lo strato medio-superiore e raccogliere l'interfase contenente i linfociti infiltranti i tessuti.
- Sciacquare le cellule con 10 mL di terreno e procedere al conteggio delle cellule, alla citometria a flusso, all'aliquotazione e al congelamento delle cellule o al protocollo di espansione NK primario.
