Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Espansione delle cellule NK dai tessuti epatici (Giorno 0), come mostrato nella Figura 1.
NOTA: Il numero iniziale di cellule e la vitalità sono fortemente correlati con il tempo trascorso dalla rimozione dell'organo e la quantità iniziale di campione di tessuto. Tuttavia, se i tessuti vengono posti in 30 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e conservati in ghiaccio o in frigorifero a 4 °C per una notte, le cellule NK possono ancora essere espanse ad alta purezza e vitalità fino a 24 ore dopo.
- Identificare le aree tissutali vitali per ottenere linfociti da tessuti e sezioni utilizzando apparecchiature chirurgiche sterili.
- Mettere i fazzoletti in 30 ml di HBSS (senza calcio o magnesio) e tenerli in ghiaccio fino al momento di prepararsi per l'isolamento.
- Tritare il tessuto in cubetti di <0,5 cm utilizzando lame di rasoio sterili o forbici e pinze all'interno di una cappa di biosicurezza.
- Preparare una soluzione 1x collagenasi IV (1 mg/mL) diluendo un stock 10x in HBSS (10x Collagenasi IV: 10 mg/mL o ~200 U/mL).
- Posizionare i pezzi di tessuto tritato nelle provette dissociatrici dei tessuti. Riempire le provette con non più di 4 g di tessuto e immergere i pezzi di tessuto in ~10 mL di 1x collagenasi IV.
nota: L'uso di DNasi I non è raccomandato in quanto potrebbe ridurre leggermente la vitalità e la resa di NK. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i tubi dissociatori tissutali specifici utilizzati.
- Posizionare le provette dissociatrici tissutali in un dissociatore tissutale e frullare a 37 °C per tritare accuratamente il tessuto.
nota: Per il tessuto epatico, questo può richiedere più di 30 minuti. Per un tessuto più friabile, possono essere sufficienti circa 15 minuti. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per le provette dissociatrici tissutali specifiche e per il dissociatore tissutale utilizzato.
- Rimuovere le provette del dissociatore tissutale e triturare attraverso un filtro cellulare in nylon da 40 μm utilizzando la parte posteriore di una siringa da 5 ml. Raccogli l'eluente e scarta i grandi frammenti non digeriti.
- Centrifugare l'eluente a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante.
- Risospendere i pellet cellulari in silice rivestita di polivinilpirrolidone (PVP) al 30% per rimuovere le cellule adipose che altrimenti contaminerebbero la frazione linfocitaria finale.
- Per preparare 1x silice rivestita in PVP, utilizzare una diluizione 9:1 di silice rivestita in PVP in 10x PBS.
nota: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per la silice rivestita in PVP specifica utilizzata.
- Per preparare il 30% di silice rivestita in PVP, diluire 1 silice rivestita in PVP con PBS/HBSS.
- Centrifugare il pellet della cella a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 9 mL di terreno R-10.
nota: Fare riferimento alla tabella dei materiali per la composizione dei mezzi R-10
- Sovrapporre accuratamente la sospensione cellulare su 4 mL di terreno di separazione di Ficoll o linfociti per separare i linfociti dai globuli rossi e dalle cellule polimorfonucleate.
- Separare gli strati centrifugando a 400 x g per 23 minuti a temperatura ambiente con accelerazione e freni disinseriti o al minimo. Decantare accuratamente lo strato medio-superiore e raccogliere l'interfase contenente i linfociti infiltranti i tessuti.
- Sciacquare le cellule con 10 mL di terreno e procedere al conteggio delle cellule, alla citometria a flusso, all'aliquotazione e al congelamento delle cellule o al protocollo di espansione NK primario.
2. Espansione primaria delle cellule NK da PBMC (o CB o tessuti d'organo) (Giorno 0), come mostrato nella Figura 2.
- Scongelare la PBMC congelata e le cellule di alimentazione congelate e irradiate in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Lavare separatamente le PBMC e le 100 celle da 221 mIL-21 irradiate con raggi gamma (irradiate con Gy) mediante centrifugazione a 400 x g per 5 minuti con 10 mL di terreno R-10.
- Conservare 1 x 106 cellule di PBMC per la citometria a flusso.
nota: La purezza iniziale delle cellule NK è un fattore importante nel calcolo del tasso di espansione delle cellule NK.
- Risospendere le cellule in 1 mL di terreno R-10. Conta le celle usando Trypan Blue.
- Miscelare 5 x 106 cellule di PBMC con 10 x 106 celle di 100 celle 221-mIL-21 irradiate con Gy in una speciale piastra a 6 pozzetti (vedere la Tabella dei materiali).
- Aggiungere 30 mL di terreno R-10 integrato con IL-2 (200 U/mL) e IL-15 umana (5 ng/mL) (vedere la Tabella dei Materiali).
- Incubare la speciale piastra a 6 pozzetti a 37 °C con CO2 al 5%.
- Sostituire il terreno con un terreno R-10 integrato con IL-2 umana (200 U/mL) e IL-15 umana (5 ng/mL) per mantenere le cellule NK ogni 3-4 giorni.
nota: Mantenere meno di 20 x 106 celle per pozzetto per un'ulteriore espansione ad ogni cambio di fluido. Per la migliore vitalità, assicurarsi che il numero totale di cellule in ciascun pozzetto non superi 100 x 106 cellule.
- Registrare il numero totale di cellule, la vitalità ed eseguire la citometria a flusso ogni 3-4 giorni per calcolare il tasso di espansione delle cellule NK.
