Espansione ex vivo di cellule natural killer da cellule mononucleate del sangue periferico

Abstract

Fonte: Ma, M., et al. Natural Killer (NK) e metodo di espansione cellulare CAR-NK utilizzando la linea cellulare B modificata IL-21 legata alla membrana. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video mostra una tecnica per l'espansione di cellule natural killer (NK) direttamente dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) utilizzando una linea cellulare alimentatrice. Le PBMC sono co-coltivate con cellule alimentatrici linfoblastoidi geneticamente modificate che esprimono l'interleuchina-21 legata alla membrana (mIL-21) e la coltura è integrata con le citochine interleuchina-2 (IL-2) e interleuchina-15 (IL-15). Insieme, questo cocktail di ligandi porta all'espansione prolungata delle cellule NK con elevata purezza.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Espansione delle cellule NK dai tessuti epatici (Giorno 0), come mostrato nella Figura 1.

NOTA: Il numero iniziale di cellule e la vitalità sono fortemente correlati con il tempo trascorso dalla rimozione dell'organo e la quantità iniziale di campione di tessuto. Tuttavia, se i tessuti vengono posti in 30 ml di soluzione salina bilanciata d....

Risultati

Figura 1: Diagramma dell'espansione delle cellule NK da campioni di organi umani solidi. In breve, i campioni di fegato umano ottenuti vengono tritati in piccoli cubetti per la digestione meccanica. Le cellule dissociate vengono quindi isolate utilizzando silice rivestita di PVP e terreni di separazione dei linfociti. Inoltre, le cellule NK vengono espanse utilizzando il protocollo di espansione desc.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra G-REX a 6 pozzetti	Wilson Wolf	80240M	Per l'espansione delle cellule NK
AF647-coniugato AffiniPure F(ab')2 frammento di capra anti-umano IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Codice 109-606-088	Per citometria a flusso
Collagenasi IV	sigma	C4-22-1G	Per l'isolamento TIL
Terreni di crioconservazione	Corning	35-010-CV	90%
Ingrediente: Siero fetale bovino (FBS)
Terreni di crioconservazione	sigma	D2050	10%
Ingrediente: Dimetilsolfossido (DMSO)
delicati tubi a C MACS	Miltenyi Biotec	Codice 130-093-237	Per l'isolamento TIL
gentleMACS Octo	Miltenyi Biotec	citare	Per l'isolamento TIL
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS - senza calcio o magnesio)	ThermoFisher	14170120	Per l'isolamento TIL
IL-15 umana	Peprotech	200-15	Per l'espansione delle cellule NK
IL-2 umana	Peprotech	200-02	Per l'espansione delle cellule NK
Celle di alimentazione irradiate da 221 mIL21	Generato nel laboratorio del Dr. Dongfang Liu		Congelato in terreni di crioconservazione
Mezzi di separazione linfocitaria	Corning	25-072-CV	Per l'isolamento TIL
PE anti-umano CD3 clone HIT3a	Bioleggenda	300308	Per citometria a flusso
Clone di CD56 (NCAM) anti-umano PE/Cy7 5.1H11	BioLeggenda	362509	Per citometria a flusso
Percoll	GE Sanità	17089101	Per l'isolamento TIL
Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)	Centro trasfusionale di New York		Isolato da plasma di donatori sani, congelato in terreno di crioconservazione
Mezzi R-10	VWR	45000-404
Ingredienti: RPMI 1640
Mezzi R-10	VWR	45000-304	1%
Ingrediente: L-glutammina
Mezzi R-10	VWR	45000-652	1%
Ingrediente: Penicillina Streptomicina
Mezzi R-10	Corning	35-010-CV	10%
Ingrediente: Siero fetale bovino (FBS)
Tripan Blu	Corning	25-900-Cl	Per il conteggio delle cellule