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1. Preparazione dei vetrini per far aderire le cellule di Raji
- Aggiungere 150 μL di fibronectina (100 μg/mL) per pozzetto a un vetrino da 8 micropozzetti (vetrino con fondo in plastica) e incubarlo per 30 minuti a 1 ora a 37 °C. Questo substrato di adesione consentirà il legame delle cellule Raji al fondo del pozzetto (Fase 2), la formazione di coniugati viventi con le cellule Jurkat (Fase 4) e la cattura al microscopio time-lapse (fase 6), ed è anche compatibile in seguito con la fissazione opzionale della paraformaldeide (PFA).
NOTA: Per il fissaggio dell'acetone, utilizzare vetrini della camera inferiore in vetro e poli-L-lisina (20 μg/mL) invece della fibronectina, poiché l'acetone dissolve la plastica. Il vetrino da 8 micropozzetti (1 cm2 pozzetti, volume massimo 300 μl) o equivalente è un formato flessibile e appropriato.
- Aspirare la fibronectina utilizzando una pipetta automatica da 200 μL e lavare ogni pozzetto con 200 μL di PBS per 2 minuti agitando delicatamente. Ripetere il lavaggio ancora una volta. In questa fase, il vetrino della camera può essere conservato con PBS per 1-2 settimane a 4 °C.
2. Adesione delle cellule di Raji ai vetrini della camera e marcatura della 7-ammino-4-clorometilcumarina (CMAC)
- Trasferire 10 mL di una pre-coltura confluente (1-2 x 106 cellule/mL) di cellule Raji in una provetta da 15 mL con fondo a V. Mescolare bene e utilizzare 10 μl per contare le cellule sulla camera Neubauer o equivalente.
- Centrifugare le celle rimanenti a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare e scartare il surnatante.
- Risospendere delicatamente il pellet cellulare in un terreno di coltura completo caldo (RPMI 1640 integrato con FCS al 10%, 2 mM di glutammina, 10 mM di HEPES, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina) a una concentrazione di10-6 cellule/mL. Usa l'equazione data di seguito:
([ ]iniziale x Viniziale = [ ]finale x Vfinale), dove [ ]iniziale rappresenta la concentrazione iniziale della cellula, Viniziale = volume iniziale della sospensione cellulare, [ ]finale = concentrazione finale della cellula, Vfinale = volume finale della sospensione cellulare.
NOTA: A seconda della concentrazione cellulare della coltura di partenza, è possibile raccogliere più cellule del necessario, ma è importante mantenere le cellule rimanenti in coltura (37 °C) fino alla fine dell'esperimento per evitare potenziali problemi (vedere la fase 2.6).
- Etichettare le cellule Raji per consentirne l'identificazione durante la formazione del coniugato sinaptico. In questo esperimento, la marcatura della 7-ammino-4-clorometilcumarina (CMAC) viene eseguita nella fase 2.4.2.
- Trasferire il numero richiesto di cellule Raji nel terreno di coltura in una provetta da 2 mL. Per i vetrini della camera a 8 micropozzetti, è necessario un totale di 1,6 mL di sospensione cellulare (200 μL per pozzetto).
- Aggiungere CMAC a una concentrazione finale di 10 μM. Mantenere le cellule al buio coprendo la provetta con un foglio di alluminio, poiché il CMAC è sensibile alla luce. Sono necessari 200 μl contenenti 2 x 105 cellule Raji per 1 cm2 pozzetto. Pertanto, se è necessario preparare 8 pozzetti, sono necessarie 1,6 x 10celle da 6 Raji.
NOTA: L'etichettatura delle cellule Raji con il blu del tracciatore cellulare (CMAC, eccitazione UV ed emissione blu) le distingue dalle cellule Th quando si formano i coniugati sinaptici. Questo colorante è compatibile con i fissativi PFA e acetone e consente ulteriori procedure di immunofluorescenza. Cerca di evitare l'esposizione alla luce. La marcatura delle cellule di Raji in un pool con CMAC seguita da risospensione prima dell'adesione delle cellule di Raji ai vetrini della camera rivestiti di fibronectina garantisce la marcatura omogenea delle cellule di Raji con CMAC tra i diversi pozzetti.
- Risospendere le cellule colorate con CMAC e, dopo l'aspirazione del PBS nel vetrino della camera dal punto 1.2., trasferire 200 μl della sospensione cellulare in ciascun pozzetto dei vetrini della camera rivestiti di fibronectina preparati nei passaggi 1.1-1.2. Incubare il vetrino della camera a 37 °C, 5% CO2 per 30 min-1 h.
NOTA: L'adesione e l'etichettatura CMAC avverranno contemporaneamente in questa fase e ciò consente di risparmiare tempo. Si prega di essere consapevoli del fatto che le cellule Raji sedimentano rapidamente ed è necessario prestare attenzione per mantenere una concentrazione omogenea nella sospensione cellulare prima della semina. Non è necessario lavare il CMAC in questa fase mediante centrifugazione poiché il lavaggio del CMAC sarà più facile da eseguire al passaggio 2.7 (quando le cellule Raji marcate hanno già aderito ai vetrini della camera). Poiché il CMAC è presente nella sospensione cellulare in grande eccesso, il fondo di fluorescenza blu è troppo alto per distinguere le cellule colorate di blu. Controllare la fluorescenza CMAC della cella al passaggio 2.7 dopo il lavaggio CMAC.
- Assicurarsi che le cellule di Raji aderiscano al fondo dei pozzetti agitando delicatamente i vetrini della camera al microscopio. Assicurarsi che le celle presentino spazi vuoti tra loro e non siano confluenti (Figura 1, pannello centrale). Il 50-60% della confluenza cellulare è appropriato.
- Se la maggior parte delle cellule aderisce in modo efficiente al vetrino della camera e non si osservano spazi vuoti tra le cellule, lavare ciascun pozzetto con un terreno completo caldo e risospendere il terreno con una pipetta automatica da 200 μl per staccare le cellule in eccesso. Controllare la confluenza dopo ogni fase di risospensione.
- Se le cellule non aderiscono, ripetere nuovamente la fase di adesione e aumentare il tempo di adesione e/o il numero di cellule.
NOTA: È possibile fermarsi qui, incubare il vetrino della camera a 37 °C, 5% CO2 durante la notte (O/N) e continuare con il protocollo il giorno successivo. Si prega di confermare il giorno successivo che le cellule Raji rimangono aderenti e marcate con CMAC utilizzando la microscopia a fluorescenza.
- Lavare nuovamente accuratamente ogni pozzetto con RPMI integrato a caldo per eliminare l'eccesso di CMAC e verificare l'emissione di blu con il microscopio a fluorescenza (Figura 1).
NOTA: Per evitare l'uso di olio da immersione (appiccicoso e viscoso) e di obiettivi ad olio ad alta apertura numerica, è possibile utilizzare obiettivi a lunghissima distanza (ad esempio, 20x o 40x) per controllare rapidamente l'etichettatura CMAC utilizzando il microscopio a fluorescenza.
3. Pulse of CMAC — Cellule Raji marcate con enterotossina E stafilococcica
- Aggiungere l'enterotossina E stafilococcica (SEE, 1 μg/mL) a ciascun pozzetto. Il SEE può essere convenientemente diluito in un terreno di coltura cellulare (soluzione di lavoro a 100 μg/mL) dalle scorte congelate di SEE (1 mg/mL in PBS). Utilizzare 2 μl della soluzione di lavoro 100x per micropozzetto da 200 μl.
ATTENZIONE: Utilizzare i guanti per questo passaggio e smaltire la punta usata nella scatola del rischio biologico.
- Incubare il vetrino della camera a 37 °C, 5% CO2 per almeno 30 minuti. L'effetto SEE dura almeno 3-4 ore.
NOTA: SEE può essere aggiunto ai pozzetti in diversi punti temporali quando necessario se sono pianificate diverse configurazioni time-lapse (passaggio 5) e/o a seconda del punto di inizio per gli esperimenti del punto finale (passaggio 6).
4. Preparazione delle celle Jurkat
- Per questo esperimento utilizzare una coltura precedentemente coltivata di cellule Jurkat (1-2 x 106 cellule/mL). Utilizzare cellule provenienti da un pallone di coltura standard o da una trasfezione precedente seguendo protocolli di elettroporazione standard, come descritto in precedenza. La trasfezione delle cellule Jurkat consentirà la visualizzazione in time-lapse del traffico di granuli secretori nelle cellule viventi. Ad esempio, quando viene espressa GFP-CD63 (un marcatore di MVB), è possibile registrare il movimento delle vescicole decorate con GFP-CD63.
- Osservare le cellule al microscopio a contrasto di fase. Se si osserva un eccesso di cellule morte (>20-30%), eseguire la centrifugazione in gradiente di densità di Ficoll utilizzando protocolli standard, per eliminare l'eccesso di cellule morte (le cellule morte mostrano una densità maggiore rispetto alle cellule viventi) prima dell'uso (vedere Discussione).
- Trasferire le cellule in una provetta da 15 mL, in una provetta con fondo a V e utilizzare 10 μL per il conteggio con un emocitometro.
- Centrifugare le celle rimanenti come descritto al punto 2.2. Scartare il surnatante e risospendere le cellule alla stessa concentrazione delle cellule di Raji (1 x 106/mL) utilizzando un terreno di coltura fresco e caldo. Seguire i passaggi 2.2-2.3.
- Mantenere le cellule Jurkat in coltura (37 °C, 5% CO2) in attesa della fase 4.
NOTA: Nella seconda opzione (trasfezione), il numero di cellule viventi sarà molto più basso rispetto alla prima. Pertanto, prendi in considerazione l'utilizzo di un volume iniziale di coltura cellulare più elevato per avere abbastanza cellule per l'esperimento. Da 10 x 106 celle Jurkat per cuvetta elettroporazione e trasfezione, solo 2-4 x 106 cellule Jurkat sopravviveranno dopo 48 ore di trasfezione e alcune di queste cellule andranno perse durante la fase di Ficoll. Pertanto, una cuvetta di elettroporazione è generalmente sufficiente per sfidare le cellule Raji pulsate SEE aderenti da 8 micropozzetti (sono necessarie6 celle Jurkat trasfettate).
5. Co-seeding delle cellule Raji e Jurkat
- Estrarre dall'incubatore i vetrini della camera contenenti le cellule Raji aderenti marcate con CMAC, pulsate SEE, dal passaggio 3.2. Non è necessario lavare il CMAC in questa fase, poiché ciò è stato precedentemente fatto nel passaggio 2.7.
- Aspirare con cura il terreno di coltura di ciascun pozzetto, uno per uno, da un angolo del pozzetto utilizzando una pipetta automatica da 200 μl. Non lasciare che il fluido nel pozzetto si asciughi completamente.
- Sostituire immediatamente il terreno con 200 μL di cellule Jurkat risospese in terreno di coltura cellulare (1 x 106/mL) preparato allo step 4.5. Se viene eseguito l'imaging time-lapse, andare al passaggio 6 subito dopo questo passaggio, poiché le cellule Jurkat tendono a sedimentare e formare coniugati sinaptici molto rapidamente. Per comodità, i micropozzetti contenenti cellule Raji aderenti pulsate con SEE che non ricevono la semina con le cellule Jurkat in questa fase devono essere mantenuti con un terreno di coltura cellulare fino alla successiva sfida con le cellule Jurkat. Ciò consentirà in modo flessibile le successive sfide con le celle Jurkat per ulteriori approcci sperimentali time-lapse o a cinetica inversa con punto finale.
- Se si intende eseguire un time-lapse, procedere rapidamente al passaggio 6. Ciò comporta la co-coltura per 1-2 ore sul microscopio o equivalente a 37 °C, 5% CO2 per consentire la formazione del coniugato sinaptico e l'acquisizione simultanea dell'immagine. Se è prevista l'analisi dell'endpoint, ma non il time-lapse, controllare la formazione del coniugato dopo il periodo di co-coltura utilizzando il microscopio (come in Figura 1) prima di fissare le cellule.
6. Imaging time-lapse di coniugati sinaptici emergenti
- Preparare il microscopio e la camera di incubazione prima dell'imaging. Per l'esempio, le impostazioni dettagliate della microscopia sono mostrate nella Figura 2.
NOTA: Se è previsto un esperimento time-lapse, tutte le impostazioni e i complementi del microscopio (camera di coltura cellulare ambientale, ecc.) devono essere preparati prima di aggiungere la sospensione Jurkat al vetrino della camera con cellule Raji aderenti. I seguenti passaggi sono descritti per un microscopio commerciale (Tabella dei materiali). Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi microscopio a fluorescenza invertita dotato di un incubatore per colture cellulari.
- Utilizzare un microscopio con immersione in olio 60x e un'elevata apertura numerica per l'imaging del traffico polarizzato.
- Assicurarsi che il sistema di messa a fuoco automatica sia attivato e regolare l'offset per mettere a fuoco le celle Raji legate alla superficie inferiore. Fare riferimento alla Figura 1.
- Dopo l'aggiunta di Jurkat a ciascun pozzetto contenente le cellule di Raji aderenti al passaggio 5.3, individuare rapidamente il vetrino della camera a micropozzetti sull'incubatore preriscaldato (1-2 ore) del microscopio (ad esempio, OKOlab) e selezionare alcune posizioni XY con il microscopio, campi in cui è probabile registrare una formazione IS emergente formata, ad esempio, da una cellula trasfettata da Jurkat che cade nel fuoco del microscopio.
- Utilizzare un'incubatrice da microscopio preriscaldata poiché è stato osservato che un tavolino stabilizzato in temperatura mantiene stabili le posizioni X, Y, Z. I criteri per un campo XY conveniente sono: celle di Raji ben focalizzate e non confluenti (cioè che mostrano spazi tra le cellule) e la presenza di celle Jurkat trasfettate (questo può essere verificato combinando la trasmittanza e i canali UV o GFP). Le cellule Jurkat sedimenteranno molto rapidamente (pochi minuti) sul vetrino della camera e le possibilità di visualizzare le sinapsi emergenti diminuiranno con il tempo (Figura 1). È possibile terminare l'esperimento dopo il time-lapse definito o procedere alla fase 7 e fissare i coniugati per la successiva immunofluorescenza e analisi.
NOTA: È possibile selezionare fino a 16 diversi campi di microscopio da un massimo di 4 diversi micropozzetti per l'acquisizione simultanea in time-lapse multi-pozzetto con la corretta risoluzione temporale (1-2 minuti per fotogramma). La limitazione si basa sia sul numero che sull'intensità (che influenza l'esposizione della telecamera) dei diversi fluorocromi da visualizzare (a seconda del numero di proteine fluorescenti espresse, a parte la CMAC). Un modo per aumentare la frequenza dei fotogrammi consiste nel registrare per il canale CMAC solo in uno dei "n" intervalli di tempo per GFP (cioè n = 8, come mostrato nella Figura 2) poiché le celle Raji aderiscono al fondo del pozzetto e non si muovono facilmente come celle Jurkat. Inoltre, ciò va a vantaggio della vitalità cellulare, poiché l'esposizione frequente ai raggi UV può danneggiare le cellule. Provare a regolare la frequenza dei fotogrammi temporali su 1 fotogramma ogni 1 minuto o meno (ad esempio, 20 s per fotogramma, Figura 2) poiché la polarizzazione di MVB richiede da alcuni minuti a ore per essere completata. Per eseguire questa acquisizione multicanale è necessario un microscopio dotato di una torretta motorizzata per epifluorescenza e di appropriati filtri a fluorescenza passa-banda o equivalenti.
