Riconoscimento del marcatore CD di cellule killer umane indotte da citochine mediante citometria a flusso

Abstract

Fonte: Hsiao, C. H., et al. Isolamento ed espansione di cellule T killer indotte da citochine citotossiche per il trattamento del cancro. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, dimostriamo una tecnica basata sulla citometria a flusso per determinare la proporzione di cellule T killer indotte da citochine, cellule CIK, espanse da una coltura cellulare mononucleata nel sangue periferico.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Introduzione ed espansione della CIK

1. Il giorno 0, coltivare le PBMC (1 x 10⁶) in terreno basale fresco contenente 1.000 UI/mL di IFN-γ per 24 ore in un incubatore per colture cellulari umidificato a 37 °C e 5% di CO₂.
2. Il giorno 1, rinfrescare il terreno con un terreno basale fresco contenente 50 ng/mL di anticorpi anti-CD3, 1 ng/mL di IL-1α rh e 1.000 U/mL di IL-2 rh. Rinfrescare il terreno ogni 3 giorni.
3. Il giorno 7, rinfrescare il terreno con terreno basale fresco contenente 1.000 U/mL di rh IL-2. Rinfrescare il terreno ogni 3 giorni fino alla fine dell'espansione della cella (Giorno 14).

2. Immunofenotipizzazione per la valutazione delle cellule CIK

1. Lavare le cellule CIK con 10 mL di PBS sterile. Centrifugare per 10 minuti a 300 x g e 18−20 °C, aspirare il surnatante e risospendere le cellule con 10 mL di PBS. Contare il numero di cellule e testare la vitalità delle cellule utilizzando il test di esclusione del blu di tripano.
2. Aliquotare le cellule CIK in sei provette sterili da 1,5 mL a una densità di ~5-10 x 10⁵ cellule/mL di PBS. Etichettare e trattare come segue: provetta 1, bianco (senza anticorpi); Provetta 2, aggiungere 20 μL di isotipo IgG1-FITC; Provetta 3, aggiungere 20 μL di anticorpi monoclonali dell'isotipo IgG1-APC; Provetta 4, aggiungere 20 μL di CD3-FITC; Provetta 5, aggiungere 20 μL di anticorpi monoclonali CD56-APC; e la provetta 6, aggiungere 20 μl di CD3-FITC e 20 μl di mAb CD56-APC.
3. Mescolare delicatamente le cellule CIK con gli anticorpi pipettandole delicatamente su e giù almeno 3 volte con una pipetta sterile da 1 ml, quindi incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
4. Centrifugare le provette per 10 minuti a 300 x g e 18-20 °C. Aspirare il surnatante e sospendere il pellet cellulare una volta con 1 mL di PBS. Pipettarli delicatamente su e giù almeno 3 volte con una pipetta sterile da 1 ml.
5. Ripetere il passaggio 2.4.
6. Lasciare le provette al buio prima dell'analisi citofluorimetrica.

3. Riconoscimento del marcatore CD

1. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 5 mL di polistirene a fondo tondo con un tappo per filtro cellulare (maglia da 100 μm) pipettando delicatamente attraverso il tappo. Metti in ordine i tubi sulla giostra.
2. Aprire il software di analisi della citometria a flusso e creare una cartella sperimentale. Fare clic sul pulsante Nuovo campione per aggiungere un campione e una provetta all'esperimento e denominare le provette come segue: Tubo 1, Vuoto; provetta 2, isotipo IgG1-CD3; Provetta 3, isotipo IgG1-CD56; Tubo 4, CD3; Tubo 5, CD56; Tubo 6, CD3CD56.
3. Creare un sistema di dispersione per le popolazioni di cellule CIK (Figura 1A).
   1. Seleziona Tubo 1 (vuoto) e fai clic sul pulsante Dot Plot per creare un grafico FSC-A/SSC-A. Disegna un cancello rettangolare sull'intera popolazione cellulare con una soglia FSC-A >5 x 10⁴ per escludere i detriti cellulari.
   2. Selezionare il parametro SSC-A/SSC-H per il nuovo dot plot e disegnare un gate poligonale attorno a tutte le singole celle. Selezionare i parametri Count/FITC (CD3) e Count/APC (CD56) rispettivamente per il nuovo grafico dell'istogramma. Selezionare il parametro FITC (CD3)/APC (CD56) per il nuovo dot plot e disegnare una porta a quattro quadranti per definire le quattro sottopopolazioni.
   3. Registra i dati di 20.000 singole cellule in ogni campione. Fare clic sul pulsante Carica campione per analizzare prima il campione di controllo vuoto. Identificare l'intera popolazione di cellule CIK utilizzando i parametri dei canali CD56 e CD3.
4. Ripetere il passaggio 3.3 per l'indagine di tutti i campioni.
5. Aprire i file contenenti i valori statistici del singolo campione per analizzare le popolazioni di cellule CIK e ristamparli in file di analisi.

Risultati

Figura 1: La proporzione di cellule T CD3⁺CD56⁺ da un campione rappresentativo di PBMC.(A) I linfociti sono stati riconosciuti in base alle dimensioni e alla granularità specifiche. Popolazione di singole cellule selezionata per l'analisi mediante citometria a flusso. (B) L'analisi statistica dell'efficacia dell'espansione della CIK da tre donatori sani è stata condotta utilizz...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpo anti-umano CD56 del topo APC	Bd	555518	B159
APC Mouse IgG1, controllo isotipo κ	Bd	555751	MOPC-21
Citometro a flusso BD FACSCanto II	Bd	338962	SN: R33896202856
Aquila modificata di Dulbecco Medium/F12	HyClone	SH30023.02	Terreno basale per colture cellulari OC-3
Siero fetale bovino	HyClone	SH30084.03	Per colture cellulari K562 e OC-3. Il terreno completo contiene il 10% di FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Scienze della vita	71101700-EK	Soluzione del gradiente di densità
FITC Anticorpo CD3 umano di topo	Bd	555332	UCHT1
FITC IgG1 di topo, controllo isotipo κ	Bd	555748	MOPC-21
MAb anti-CD3 umano	Takara	T210	OKT3 Aggiungere 2,5 mL di brodo (1 mg/1 mL) a 50 mL di terreno di induzione. Stock di stoccaggio a -80 °C
RPMI1640 medio	Gibco	Codice 11875-085	Terreno basale per coltura cellulare K562. Scorte di stoccaggio a 4 °C