Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Trasferimento adottivo di cellule T CD8+ antigenico-specifiche nei topi
- Isolare le cellule T CD8+ specifiche per l'ovoalbumina (OVA) (OTI) che esprimono la proteina fluorescente verde (OTI-GFP) o la proteina fluorescente rossa (OTI-RFP) dalla sospensione linfonodale di topi transgenici con recettore delle cellule T utilizzando un kit di isolamento delle cellule T CD8+ di topo secondo le istruzioni di produzione. Preparare la sospensione cellulare frantumando i linfonodi con uno stantuffo della siringa, come descritto in precedenza.
- Trasferire le cellule OTI-GFP o OTI-RFP (3 x 106 cellule) in riceventi di topi selvatici C57BL/6 mediante iniezione endovenosa come descritto da Cahalan, et al. Utilizzare topi che hanno tipicamente 6-12 settimane di età.
nota: Questo passaggio è facoltativo e richiesto solo per il monitoraggio delle cellule T CD8+ antigene-specifiche.
2. Infezione da Listeria monocytogenes
- Espandere L. monocytogenes geneticamente modificato per esprimere OVULI (LM-OVA) a una fase esponenziale di crescita in infusione di cuore in brodo a 37 °C sotto leggera agitazione fino a quando l'OD600 raggiunge 0,08-0,1, come precedentemente descritto.
- Iniettare 100 μL (volume massimo = 200 μL) di 0,1-0,5 LD50 LM-OVA diluito in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) mediante iniezione endovenosa utilizzando una siringa da insulina da 29 G, in riceventi di topi C57BL/6 wild-type portatori di cellule OTI-GFP o OTI-RFP quando indicato.
nota: Nelle nostre mani, 0,1 x LD50 LM-OVA corrisponde a 2 x 104 unità formanti colonie (CFU). L. monocytogenes, geneticamente modificato per esprimere OVA, viene utilizzato per attivare le cellule T OTI CD8+ precedentemente trasferite, ma possono essere utilizzati altri ceppi di L. monocytogenes.
3. Trattamento con Brefeldina A (BFA) per bloccare la secrezione di citochine
- Iniettare 250 μg di BFA in 200 μL di PBS per via intraperitoneale per 6 ore prima del sacrificio del topo utilizzando una siringa da insulina da 29 G.
nota: Il BFA liofilizzato viene prima risospeso in dimetilsolfossido (DMSO) per preparare una concentrazione di 25 mg/mL. Il BFA viene quindi diluito in PBS a temperatura ambiente (RT) per evitare la cristallizzazione prima dell'iniezione. L'inibizione della secrezione di citochine induce l'accumulo di IFNγ nelle cellule. Questo è fondamentale per il rilevamento delle citochine.
4. Raccolta della milza
- Eutanasia dei topi utilizzando concentrazioni crescenti di CO2 seguite da lussazione cervicale.
nota: Seguire le linee guida dell'istituzione locale per l'eutanasia umana dei topi.
- Pulisci l'addome con etanolo al 70% e fai un'incisione con le forbici per fare un taglio di 1-2 cm attraverso la pelle sul fianco sinistro del topo, dove si trova la milza. Praticare con cura un'incisione nel peritoneo per esporre la milza ed estrarla con una pinzetta. Raccogli la milza, facendo attenzione a non schiacciarla con il forcipe o tagliarla per evitare di interrompere l'architettura della milza.
5. Fissazione della milza con paraformaldeide (PFA)
- Preparare la soluzione fissativa mescolando 3,75 mL di PBS e 3,75 mL di 0,2 M di L-lisina. Aggiungere 21 mg di m-periodato di sodio e mescolare bene. Quindi aggiungere 2,5 mL di PFA al 4% e 20 μL di NaOH.
nota: Utilizzare la soluzione fissativa lo stesso giorno e scartare l'eccesso. Non conservarlo. Questa fase di fissazione è importante se il campione contiene proteine fluorescenti come la GFP. Non utilizzare PFA contenente tracce di metanolo, poiché denatura le proteine fluorescenti.
cautela: Il PFA è tossico e deve essere maneggiato con cautela.
- Immergere la milza nel fissativo e fissarla per un minimo di 4 ore, in genere 16-20 ore a 4°C con una leggera agitazione.
- Scartare la soluzione fissativa e aggiungere 5 mL di PBS per 5 minuti a RT con leggera agitazione.
- Sostituire il PBS con 5 mL di PBS fresco e incubare per 1 ora a 4 °C agitando delicatamente.
- Sostituire il PBS con 5 ml di saccarosio al 30% e incubare per 12-24 h.
nota: Questo metodo aiuta a mantenere la morfologia dei tessuti. Dopo l'incubazione con soluzione di saccarosio, l'organo dovrebbe affondare sul fondo del pozzo.
6. Congelamento e sezionamento
- Metti il ghiaccio secco in un recipiente grande e metti all'interno un recipiente più piccolo contenente circa 50 ml di metanolo puro e alcuni pezzi di ghiaccio secco.
- Asciugare delicatamente la milza con un panno privo di lanugine.
- Posizionare la milza all'interno di uno stampo di base contenente una goccia di composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT) sul fondo. Fare attenzione a non produrre bolle. Aggiungere l'OCT sulla milza.
- Con una pinza, depositare lo stampo di base sulla superficie del metanolo, facendo attenzione che non tocchi l'OCT. Congelare il tessuto il più rapidamente possibile per ridurre al minimo gli artefatti.
- Quando è congelato, procedere con il sezionamento.
nota: La milza congelata può essere conservata a -80 °C per diversi mesi.
- Sezionare il tessuto utilizzando un crio-microtomo.
- Impostare la temperatura della camera sul criostato a -21 °C. Tagliare sezioni dello spessore desiderato (di solito circa 10 μm). Questo protocollo funziona con spessori fino a 30 μm.
- Raccogliere le sezioni sui vetrini del microscopio (vedere la Tabella dei materiali) e ispezionarle visivamente.
nota: Le sezioni possono essere mantenute a -80 °C per diversi mesi.
7. Colorazione immunofluorescente
- Consenti alla sezione di arrivare a RT.
- Disegna un cerchio con un bloccante liquido (ad es. PAP pen) attorno alla sezione di tessuto. Disegna al di fuori dell'OCT o non si attaccherà.
- Una volta asciugato, reidratare il campione posizionando il PBS sulla sezione di tessuto per 5 min.
nota: Il volume messo sulla sezione dipende dalle dimensioni della sezione. In genere utilizziamo 100-300 μl. Non lasciare asciugare le sezioni una volta reidratate.
- Risciacquare con PBS almeno due volte per assicurarsi che la sezione aderisca bene al vetrino.
- Aggiungere una soluzione bloccante alla sezione per ridurre il legame non specifico degli anticorpi.
- Preparare la soluzione bloccante come segue: PBS con Triton X100 allo 0,1%, siero di vitello fetale al 2% (FCS), 2,5 μg/mL di bloccante del recettore Fc (anti-topo CD16/32). Quindi aggiungere il 2-5% di siero normale della specie di ciascun anticorpo secondario del pannello di colorazione.
nota: Se gli anticorpi sono direttamente coniugati/biotinilati, aggiungere il 5% di siero normale della specie di ciascun anticorpo primario. Se un anticorpo primario e uno degli anticorpi secondari provengono dalla stessa specie (ad esempio, anticorpi primari allevati nel coniglio e anti-ratto secondario nel coniglio), non utilizzare le specie sieriche normali in quanto aumenteranno il segnale di fondo.
- Rimuovere delicatamente il PBS dalla sezione mediante aspirazione e aggiungere 100 μl di soluzione bloccante per ogni sezione del campione. Incubare in una camera umida coperta per un minimo di 1 ora a RT.
- Colorare con anticorpi primari.
- Diluire gli anticorpi primari alla concentrazione ottimale nella soluzione bloccante. Il punto di partenza generale della concentrazione anticorpale è di 5 μg/mL, ma deve essere ottimizzato per ogni anticorpo e tessuto.
nota: Se gli anticorpi sono coniugati direttamente, centrifugare la miscela di anticorpi a 17,135 x g (13,500 giri/min) per 15 minuti a 4 °C prima di utilizzarla. I fluorofori possono precipitare. Questo passaggio pelletterà i precipitati e quindi impedirà la deposizione non specifica degli anticorpi precipitati sul vetrino.
- Sostituire la soluzione bloccante con la miscela di anticorpi primari per ciascun campione.
- Incubare per 4 ore a RT o per una notte (OVN) a 4 °C in una camera umida coperta.
- Eseguire il lavaggio.
- Preparare il tampone di lavaggio aggiungendo il 2% di FCS al PBS.
- Lavare 4 volte con il tampone di lavaggio: una rapida (senza incubazione), una per 10 minuti e due per 5 minuti. Quindi eseguire un lavaggio finale con PBS per 5 min.
- Colorazione con anticorpi secondari.
- Diluire gli anticorpi secondari di interesse alla concentrazione ottimale nella soluzione bloccante. Centrifugare la miscela, come descritto per gli anticorpi primari.
- Rimuovere la soluzione di lavaggio finale. Aggiungere la miscela di anticorpi secondari sopra la sezione e incubare per 1-4 ore a RT in una camera umida coperta.
- Lavare 4 volte con il tampone di lavaggio: una rapida (senza incubazione), una per 10 minuti e due per 5 minuti. Quindi eseguire un lavaggio finale con PBS per 5 min.
- Rimuovere la soluzione di lavaggio finale. Lasciare evaporare il PBS ma non asciugare eccessivamente la sezione. Posizionare una goccia del mezzo di montaggio sopra il campione e posizionare con cura il vetro di copertura sopra di esso. Il supporto di montaggio deve recuperare l'intera sezione. Lasciare che la polimerasi OVN a RT protetto dalla luce.
nota: Disegna un cerchio attorno alla sezione sul retro della diapositiva prima di applicare il mezzo di montaggio. Una volta applicato il mezzo di montaggio, il tessuto potrebbe diventare difficile da vedere.
- Conservare i vetrini al buio a 4 °C fino al momento dell'acquisizione.
8. Imaging e analisi
- Eseguire l'imaging della colorazione con un microscopio confocale.
nota: In questo protocollo, è stato utilizzato un microscopio a scansione laser spettrale invertita (vedi Tabella dei materiali), insieme agli obiettivi 10x/NA 0.40 o 60x/NA 1.4 (per l'analisi della localizzazione subcellulare delle citochine). Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione sono visualizzate per ogni fluoroforo e proteina fluorescente nella Tabella dei Materiali.
- Eseguire l'analisi e la quantificazione secondo necessità utilizzando un software di elaborazione delle immagini (ad esempio, Imaris o Fiji).
