Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Purificazione piastrinica
NOTA: La purificazione delle piastrine deve essere effettuata a temperatura ambiente per prevenire la loro degradazione. Assicurarsi che la temperatura dei reagenti e degli strumenti sia compresa tra 18 e 22 °C. Per prevenire la degradazione piastrinica, è necessario evitare un pipettaggio rapido e un agitazione vigorosa durante la procedura.
- Aggiungere 600 μL di terreno di gradiente ioesolo (12% di polvere di ioesolo in cloruro di sodio allo 0,85%, 5 mM di Tricina, pH 7,2) in una provetta da 1,5 mL.
- Aggiungere lentamente 200 μl di campione di sangue lungo il lato della provetta sopra il terreno di gradiente con una punta della pipetta a foro largo in modo che il sangue e il terreno di coltura ioesolo non si mescolino (Figura 1A).
- Centrifugare il campione contenente la provetta a 400 x g per 20 minuti a 20 °C in un rotore a secchiello oscillante con accelerazione e decelerazione lente.
- Raccogliere la maggior parte dello strato ricco di piastrine e una piccola frazione dello strato povero di piastrine (totale da 300 a 400 μl) utilizzando un puntale per pipetta a foro largo senza disturbare gli strati di globuli rossi e globuli bianchi (Figura 1B). Trasferire il campione di piastrine in una nuova provetta.
nota: Se la conta piastrinica è inferiore nel sangue o viene utilizzato un volume di sangue inferiore, lo strato ricco di piastrine e lo strato povero di piastrine possono essere visti come un unico strato.
- Aggiungere 1 mL di PBS al campione di piastrine, mescolare capovolgendo e centrifugare a 800 x g per 10 minuti a 20 °C in un rotore a secchiello oscillante. Scartare completamente la soluzione e aggiungere 200 μl di PBS per risospendere le piastrine con un pipettaggio delicato.
nota: Questo passaggio è facoltativo, in quanto rimuove il mezzo di gradiente e le proteine plasmatiche e aumenta la sensibilità delle piastrine agli agonisti come la trombina. Poiché centrifughe diverse hanno programmi diversi, l'accelerazione/decelerazione lenta può essere determinata leggendo il manuale utente della centrifuga.
- Trasferire 30 μl di questo campione in una nuova provetta per contare le piastrine. Le piastrine rimanenti possono essere utilizzate per saggi biochimici e fisiologici come l'attivazione piastrinica, l'aggregazione, il rilascio di granuli, ecc.
- Per l'estrazione di RNA o proteine, centrifugare il campione di piastrine a 800 x g per 10 minuti per pellettare le piastrine. Scartare completamente il surnatante senza disturbare il pellet. Aggiungere il volume desiderato di RNA o tampone di lisi proteica per lisare le piastrine.
2. Attivazione piastrinica
- In una provetta, aggiungere da 1 a 2 milioni di piastrine purificate in un massimo di 100 μL di tampone di colorazione (PBS con siero fetale bovino al 2%, FBS).
- Per un numero multiplo di campioni, preparare una miscela master di anticorpi con 1 μL (0,5 mg/mL) dei seguenti: PE-Cy7 ratto anti-topo TER 119, PE rat anti-mouse CD45, FITC rat anti-mouse CD41 e APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectina) per rilevare rispettivamente i globuli rossi, i globuli bianchi, le piastrine e le piastrine attivate. Aggiungere la miscela master alle provette per colorare le cellule. Non aggiungere trombina.
- In un'altra provetta, aggiungere da 1 a 2 milioni di piastrine purificate in un massimo di 100 μL di tampone di colorazione e 0,4 mM di peptide GPRP. Aggiungere trombina per attivare le piastrine e colorare le cellule seguendo il passaggio 2.2.
nota: Il GPRP deve essere aggiunto al campione prima di aggiungere trombina per prevenire la formazione di aggregati o coaguli attraverso l'attivazione piastrinica. La concentrazione di trombina deve essere ottimizzata per ottenere una buona attivazione delle piastrine. Dopo l'attivazione piastrinica, la conta degli eventi diminuisce durante l'acquisizione dei campioni mediante citometria a flusso.
- Come controllo positivo, aggiungere 1 μL di sangue intero in un tampone di colorazione fino a 100 μL in una provetta e 0,4 mM di peptide GPRP. Aggiungere trombina per attivare le piastrine. Come controllo negativo, aggiungere 1 μL di sangue intero in un massimo di 100 μL di tampone di colorazione. Non aggiungere trombina al campione di controllo negativo. Colorare le celle seguendo il passaggio 2.2.
- Per il controllo degli isotipi della citometria a flusso, etichettare 5 provette con PE-Cy7, PE, FITC e APC non colorati. Aggiungere 100 μl di tampone di colorazione, 1 μl di sangue e 1 μl del rispettivo anticorpo alle provette marcate per colorare le cellule.
- Incubare i campioni per colorarli per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Lavare i campioni aggiungendo 1 mL di tampone di colorazione a ciascuna provetta. Centrifugare a 800 x g per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare con cautela il tampone colorante senza rimuovere il pellet.
- Aggiungere 300 μl di tampone di colorazione a ciascuna provetta, mescolare leggermente e trasferire in una provetta FACS. Conservare i campioni colorati al buio fino all'analisi con un citometro a flusso.
