Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di terreni, soluzioni enzimatiche e animali
- Preparare l'alcol iodio all'1% sciogliendo 1 g di iodio in 100 ml di etanolo.
- Preparare 2 x 500 ml di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS) senza Ca2+ e Mg2+ integrati ciascuno con 7,5 ml di D-glucosio (100 g/L) e 5 ml di soluzione madre 100x Penicillina/Streptomicina (15 mg/ml di D-glucosio, 50 U/ml di penicillina e 50 μg/ml di streptomicina finale).
- Integratore 1x 500 ml di terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 5 ml di soluzione madre 100x Penicillina/Streptomicina (50 U/ml di Penicillina e 50 μg/ml di Streptomicina finale).
- Preparare una soluzione di tripsina-DNasi I (2,5 mg/ml di tripsina e 10 μg/ml di DNasi I) aggiungendo 25 mg di tripsina e 0,1 ml di DNasi I (1 mg/ml di DNasi I) a 9,9 ml di PBS.
- Sciogliere 50 mg di inibitore della tripsina in 5 ml di PBS per la soluzione di inibitore della tripsina A (10 mg/ml). Sciogliere 25 mg di inibitore della tripsina in 10 ml di PBS per la soluzione di inibitore della tripsina B (2,5 mg/ml).
- Per una soluzione di collagenasi-ialuronidasi-desossiribonucleasi I (DNasi I), sciogliere 10 mg di collagenasi A (1 mg/ml finale), 10 mg di ialuronidasi (1 mg/ml finale) e 0,1 ml di DNasi I (1 mg/ml DNasi I) (10 μg/ml finale) in 10 ml di PBS.
- Preparare una soluzione di ialuronidasi-DNasi I aggiungendo 10 mg di ialuronidasi (1 mg/ml finale) e 0,1 ml di soluzione di DNasi I (1 mg/ml) (10 μg/ml finale) a 9,9 ml di PBS.
- Ordina i ratti Wistar in tempo in modo che abbiano 19 giorni il giorno dell'isolamento cellulare di Sertoli.
nota: Il protocollo descritto è progettato per 10 ratti, ma può essere modificato per un minimo di 5 e un massimo di 20 ratti. I volumi di tutte le soluzioni devono essere adeguati di conseguenza.
Nel seguente protocollo, "pipetta" sta per una pipetta sierologica.
2. Preparazione dei tubuli seminiferi
- Anestetizzare 10 ratti Wistar maschi uno per uno in un essiccatore utilizzando CO2 e una velocità di flusso che sposta almeno il 20% del volume della camera al minuto. Attendere che la respirazione si fermi, testare l'anestesia stringendo un cuscinetto per i piedi e, se non c'è reazione, sopprimere ogni ratto mediante lussazione cervicale. Drenare il sangue sezionando la vena giugulare e l'arteria carotide (vagina carotica) sotto l'acqua corrente. Disinfettare l'addome strofinandolo con etanolo al 70%.
- Usando una pinza, sollevare la pelle dai muscoli addominali e ritagliare un lobo cutaneo di forma ovale che si estende dalla sinfisi pubica allo sterno (Figura 1A) e sbatterlo verso l'alto sul petto. Quindi, afferra i muscoli addominali e fai un'incisione mediale dalla sinfisi pubica allo sterno.
- Stringere l'addome con i pollici dal bacino verso l'alto per spingere i testicoli fuori dal bacino inferiore. Raccogli il cuscinetto adiposo dell'epididimo (Figura 1B) con una pinza per sollevare ulteriormente il testicolo. Tagliare il funicolo spermatico (Figura 1B), lasciando intatta la tunica albuginea, e raccogliere tutti i testicoli in 20 ml di PBS in una provetta conica da 50 ml (Figura 1C).
- Dopo aver raccolto tutti i testicoli, disinfettarli aggiungendo un volume uguale (20 ml) di iodio all'1% (p/v) in etanolo. Capovolgere il tubo due volte e decantare immediatamente il surnatante. Lavare rapidamente i testicoli due volte con 25 ml di PBS ciascuno (Figura 1D).
- Trasferire i testicoli in una piastra di Petri contenente 15 ml di PBS (Figura 1E). Afferrare saldamente ciascun testicolo con una pinza a un'estremità, praticare una piccola incisione nella tunica albuginea all'estremità opposta e spremere i tubuli usando lame a forbice chiuse come strumento di raschiatura><.
nota: I tubuli dovrebbero ancora formare un fascio compatto a forma di testicolo con solo pochi tubuli che si estendono nella soluzione per consentire una digestione enzimatica omogenea (Figura 1F).
- Trasferire i testicoli decapsulati in un flacone da 100 ml con tappo a vite contenente 10 ml di soluzione di tripsina-DNasi I. Eseguire la digestione in un bagno d'acqua agitante a 32 °C (120 oscillazioni/min). Dopo 4 minuti valutare i tubuli ad occhio nudo per la dispersione dei tubuli. Una volta che i tubuli iniziano a disperdersi nella soluzione, interrompere immediatamente la digestione. Se necessario, continuare l'incubazione per un massimo di 2 minuti.
- Arrestare la digestione della tripsina aggiungendo 5 ml di soluzione inibitrice della tripsina A. Mescolare accuratamente la soluzione pipettando su e giù 3-4 volte utilizzando una pipetta da 10 ml e trasferirla in una provetta conica da 50 ml.
- Dopo 5 minuti di incubazione, osservare i tubuli stabilizzarsi per unità di gravità, rimuovere con cautela il surnatante utilizzando la pipetta da 10 ml del passaggio 2.6 e aggiungere 10 ml di soluzione di inibitore B della tripsina per arrestare completamente la digestione della tripsina. Risospendere i tubuli pipettandoli su e giù 2-3 volte.
- Per rimuovere le cellule interstiziali contaminanti, lavare i tubuli 9 volte con 25 ml di PBS ciascuno. Risospendere i tubuli in ogni lavaggio utilizzando una pipetta da 25 ml e lasciarli depositare per gravità unitaria per 10 minuti. Utilizzare sempre la stessa pipetta da 25 ml per il pipettaggio del PBS, la risospensione e la rimozione del surnatante.
3. Rimozione/Isolamento delle cellule peritubulari (PTC)
- Trasferire tutti i tubuli in un flacone da 100 ml con tappo a vite e aggiungere la soluzione di collagenasi-ialuronidasi-DNasi I (Figura 2A). Eseguire la digestione per 10 minuti in un bagno d'acqua agitante a 32 °C (120 oscillazioni/min).
- Pipettare una goccia della sospensione su un vetrino e controllare rapidamente i tubuli al microscopio ottico invertito per la coltura cellulare di routine con ingrandimento 100x. Se la digestione non è sufficientemente avanzata, continuare l'incubazione per altri 2 minuti (non contare il tempo necessario per il controllo microscopico).
nota: Durante questa fase tutti i tubuli si accorciano in lunghezza e i bordi dei tubuli dovrebbero diventare ruvidi (Figura 2B e C). Gli spigoli sono indicativi del rilascio di cellule peritubulari.
- Trasferire la sospensione con i tubuli digeriti in una provetta conica da 50 ml utilizzando la pipetta da 25 ml del passaggio 2.8. Lavare il flacone da 100 ml con 10 ml di PBS e aggiungerlo ai tubuli nel tubo conico. Lasciare sedimentare i tubuli digeriti per gravità unitaria per 10 minuti, aspirare con cura il surnatante, contenente i PTC, utilizzando nuovamente la pipetta da 25 ml e trasferirlo in una nuova provetta conica. Per l'aspirazione degli ultimi millilitri utilizzare una pipetta da 5 ml per evitare qualsiasi trascinamento dei tubuli.
4. Isolamento delle cellule di Sertoli (SC)
- Risospendere accuratamente i tubuli sedimentati dal passaggio 3.3 in 25 ml di PBS utilizzando una pipetta da 25 ml e lasciarli assestare per gravità unitaria per 12 minuti. Utilizzare la stessa pipetta da 25 ml per il pipettaggio del PBS, la risospensione dei tubuli e la rimozione dei surnatanti. Ripetere il lavaggio 3 volte (4 lavaggi in totale).
- Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire i tubuli digeriti in un altro flacone da 100 ml con tappo a vite contenente la soluzione di ialuronidasi-DNasi I. Eseguire la digestione in un bagno d'acqua agitante a 32 °C (120 oscillazioni/min).
- Dopo 5 minuti, controllare nuovamente i tubuli mediante ispezione al microscopio ottico con ingrandimento 100X come descritto al punto 3.2.
nota: Dovrebbero essere visibili tubuli corti, aggregati tubulari e cellule rilasciate (Figura 2D).
- Lasciare riposare gli aggregati tubulari per 10 minuti e aspirare il surnatante utilizzando una pipetta da 25 ml. Lavare gli aggregati 4 volte utilizzando 25 ml di PBS e un tempo di sedimentazione di 10 minuti per ogni fase di lavaggio (Figura 2E).
- Aggiungere 20 ml di terreno RPMI 1640 e passare la sospensione 10 volte attraverso un ago da 18 G montato su una siringa da 20 ml. Evitare le bolle d'aria.
nota: Tirare la sospensione dentro e fuori attraverso l'ago è considerato come un unico passaggio. La disgregazione e l'omogeneizzazione delle cellule mediante taglio idrodinamico è una tecnica standard nella preparazione di cellule che tendono ad aggregarsi. È improbabile che il passaggio di cellule attraverso un ago ipodermico di piccolo diametro interno abbia un impatto sulle loro proprietà funzionali. Le figure 3C e D mostrano la normale ultrastruttura delle cellule di Sertoli purificate al quarto giorno di coltura.
- Pipettare una goccia della sospensione su un vetrino e controllare rapidamente i tubuli al microscopio ottico invertito per la coltura cellulare di routine con ingrandimento 10X se gli aggregati sono tutti dispersi (Figura 2F). Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm per ottenere una sospensione monocellulare pura nel filtrato.
- Centrifugare il filtrato del passo 4.4 a 200 x g per 10 minuti a RT senza utilizzare il freno. Aspirare con cautela il surnatante utilizzando una pipetta da 25 ml e risospendere le cellule di Sertoli in un terreno RPMI 1640 da 40 ml (senza siero).
- Miscelare 100 μl di sospensione cellulare con 100 μl di Trypan Blue Stain e contare le cellule con una camera Neubauer Improved . Regolare la concentrazione delle cellule a 3 x 106 cellule/ml in base al risultato del conteggio. Seminare 1 ml per pozzetto su una piastra a 6 pozzetti (=giorno 1). nota: Le cellule di Sertoli in sospensione si depositano rapidamente, quindi la provetta deve essere agitata brevemente ogni volta prima di prelevare un'aliquota cellulare con la pipetta. Fino al giorno 4 si attaccano saldamente al substrato.
