Isolamento selettivo di cellule T CD4+ Vδ1+ γδ da cellule mononucleate del sangue periferico umano

Abstract

Fonte: Welker, C., et al. Isolamento ed ex vivo Coltura di cellule T Vδ1⁺CD4⁺γδ, un progenitore extratimico delle cellule αβT. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video dimostra un protocollo per l'isolamento basato sulla marcatura magnetica di una popolazione a bassa concentrazione di cellule T CD4⁺Vδ1⁺γδ da cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC). Utilizzando una combinazione di anticorpi anti-Vδ1 coniugati con FITC, microsfere magnetiche anti-FITC e perline superparamagnetiche rivestite con anticorpi anti-CD4, le cellule T CD4⁺Vδ1⁺ possono essere purificate con successo dalla popolazione PBMC.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Isolamento delle cellule T Vδ1

1. Assumere <1 x 10⁶ linfociti isolati per un FACS iniziale che determina la frequenza delle cellule T Vδ1 CD4.
   nota: La dimensione della popolazione di questa entità di cellule T può differire notevolmente tra gli individui e in base al loro stato immunologico. Tipicamente, circa l'1% delle cellule T sono ^Vδ1+ e circa l'1-5% delle cellule Vδ1⁺ sono CD4⁺.
   1. Diluire le cellule con 1 ml di tampone FACS, che consiste in PBS contenente il 2% di FCS e 5 mM di EDTA. Centrifugare a 660 x g per 2 min e decantare il surnatante. Il volume di riflusso di circa 100 μl di tampone FACS è sufficiente per la successiva colorazione. Agitare brevemente e incubare le cellule con 5 μl di reagente bloccante Fc per 5 minuti a RT per una maggiore specificità della colorazione FACS.
   2. Aggiungere anticorpi monoclonali umani direttamente alle cellule senza rimuovere il reagente bloccante Fc. Assicurati di colorare le cellule con anticorpi contro Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1:200), CD8 (1:200) e TCRαβ (1:25). Preparare il controllo isotipico con gli isotipi di immunoglobuline corrispondenti. Incubare le cellule con gli anticorpi per 20 minuti a 4 °C al buio.
   3. Lavare le cellule in 1 ml di tampone FACS (centrifugare per 2 minuti; a 660 x g), decantare il surnatante e procedere all'acquisizione del FACS nel volume rimanente del tampone.
2. Pellettizzare le celle (che non vengono utilizzate nell'analisi FACS) mediante centrifugazione per 12 minuti; a 300 g; 8 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 60 μl di tampone MACS per 1 x 10⁷ cellule. Aggiungere 20 μl di reagente bloccante Fc per 1 x 10⁷ cellule e incubare per 5 minuti a 4°C.
3. Aggiungere 10 μl di anticorpo Vδ1 umano coniugato con FITC per 1 x 10⁷ cellule direttamente alle cellule. Incubare per 12 minuti a 4 °C al buio.
4. Lavare le cellule con 14 ml di tampone MACS (centrifugare per 12 min; a 300 g; 8 °C). Scartare completamente il surnatante e risospendere le cellule in 80 μl di tampone MACS per 1x10⁷ cellule.
5. Prelevare 1-2 x 10⁵ celle e diluirle in 100 μl di tampone FACS per la verifica dell'etichettatura mediante analisi FACS. Per questa fase non sono necessari ulteriori additivi. Assicurarsi che ci sia una differenza sufficiente nella luminosità per le celle Vδ1^- e Vδ1⁺. In caso contrario, ripetere i passaggi 1.3 e 1.4.
6. Aggiungere 20 μl di microsfere anti-FITC per 1 x 10⁷ cellule alle cellule rimanenti, mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio a 4 °C. Successivamente, lavare le cellule utilizzando almeno 10 ml di tampone MACS (centrifugare per 12 minuti, a 300 x g; 8 °C).
7. Durante la centrifugazione, equilibrare la colonna magnetica pre-raffreddata posta in un magnete con tampone MACS da 500 μl.
8. Risospendere le cellule in un tampone MACS da 500 μl (per un numero di cellule superiore a 1 x 10⁸, aumentare di conseguenza questo volume) e applicare le cellule con cautela sulla colonna. Raccogliere il flusso contenente le celle Vδ1^-.
9. Lavare la colonna tre volte con 500 μl di tampone MACS e raccogliere nuovamente il flusso nella stessa provetta. Si noti che il serbatoio deve essere vuoto prima di applicare il tampone sulla colonna.
10. Rimuovere la colonna dal dispositivo magnetico e inserirla in un tubo conico da 15 ml. Lavare rapidamente la colonna con 1 ml di tampone MACS spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna. Raccogli l'eluato in un tubo.
    NOTA: Per ottenere una purezza del >98%, di solito è necessario ripetere i passaggi 1.7-1.9 con una seconda colonna.
11. Verificare la purezza delle cellule mediante analisi FACS con lo stesso pannello di anticorpi di prima (vedi 1.1.2) e contare le cellule.

2. Isolamento delle cellule T Vδ1CD4⁺

1. Risospendere 25 μl di microsfere CD4 con un vortice per >30 secondi. Lavare le perle (la quantità minima indicata dal produttore) in 1 ml di tampone MACS in una provetta di reazione da 1,5 ml inserendo la provetta in un magnete per 1 minuto. Eliminare con cura il surnatante con una pipetta di piccole dimensioni (200 μl) e risospendere le perle nel volume originale del tampone MACS.
2. Pellettizzare le cellule ^Vδ1+ (centrifugare per 12 minuti; a 300 x g) e aspirare il surnatante e risospendere tutte le cellule Vδ1⁺ in tampone MACS da 500 μl e aggiungerle alla provetta contenente le sfere. Mescolare energicamente e incubare per 20 minuti a 4 °C inclinando costantemente (ad es. in un rotatore).
3. Posizionare la provetta contenente le cellule in un magnete per 2 minuti. Assicurarsi che non ci siano residui nel coperchio.
   NOTA: Le celle CD4⁺ avranno legato le perle magnetiche e si attaccheranno al lato del tubo rivolto verso il magnete.
4. Aprire con cautela il coperchio mantenendo la provetta all'interno del dispositivo magnetico e raccogliere il surnatante che contiene le cellule ^CD4-Vδ1+ utilizzando una pipetta di piccole dimensioni. Posizionare le cellule ^CD4-Vδ1+ in una provetta separata e posizionare nuovamente questa provetta nel magnete per evitare che rimangano cellule CD4 o perline dalla popolazione.
   1. Lavare le cellule CD4 in 5 ml di tampone MACS (centrifugare per 12 minuti; a 300 x g) e risospenderle in una concentrazione di 1 x 10⁵ cellule per 100 μl di terreno. Le cellule CD4 possono essere facilmente coltivate in condizioni adeguate.
5. Posizionare la provetta con i bersagli delle celle CD4⁺ al di fuori del campo magnetico, risospendere le cellule in un tampone MACS da 500 μl e reinserirle nel dispositivo magnetico. Ripetere i passaggi 2.3-2.5 due volte per ottenere una purezza maggiore. Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio.
6. Risospendere le cellule CD4⁺ in un terreno di coltura da 100 μl (RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-glutammina, 1% penicillina/streptomicina) e aggiungere 10 μl di una soluzione che stacca le microlinee. Incubare a RT per 45 minuti con inclinazione costante (ad esempio, in un rotatore).
7. Posizionare le cellule in un magnete per 1 minuto. Raccogliere con cura il surnatante contenente cellule Vδ1⁺CD4⁺ prive di microsfere utilizzando una pipetta di piccole dimensioni.
8. All'esterno del magnete, risospendere le perle con 100 μl di terreno di coltura e ripetere i passaggi 2.6 e 2.7 due volte per ottenere un numero maggiore di cellule CD4⁺.
9. Pellettizzare le celle (centrifugare a 300 x g, per 12 minuti) ed eliminare completamente il surnatante mediante pipettaggio. Risospendere le cellule in un terreno fresco e preriscaldato e contarle. Esaminare la purezza delle cellule Vδ1⁺CD4⁺ mediante analisi FACS illustrata nei passaggi 1.1.1-1.1.3.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma Aldrich	D8537
Buffer MACS	Miltenyi Biotec	Codice 130-091-222	integrare con BSA e pre-raffreddare prima dell'uso
Bsa	Miltenyi Biotec	130-091-376	non obbligatoriamente da questo fornitore
anti-umano Vd1 FITC (clone: TS8.2)	Termo Scientifico	TCR2730	non obbligatoriamente da questo fornitore
anti-umano CD3 PerCP (clone: SK7)	BD Bioscienze	345766	non obbligatoriamente da questo fornitore o da questo fluorocromo
anti-umano TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)	BD Bioscienze	555548	non obbligatoriamente da questo fornitore o da questo fluorocromo
anti-umano CD4 VioBlue (clone: MT466)	Miltenyi Biotec	Codice 130-097-333	non obbligatoriamente da questo fornitore o da questo fluorocromo
anti-umano CD8 APC-H7 (clone: SK1)	BD Bioscienze	Codice 641400	non obbligatoriamente da questo fornitore o da questo fluorocromo
Kit MultiSort Anti-FITC	Miltenyi Biotec	Codice 130-058-701	produce risultati migliori rispetto alle microsfere anti-FITC
Colonne MS	Miltenyi Biotec	Codice 130-042-201	Pre-raffreddare prima dell'uso
Separatore MiniMACS	Miltenyi Biotec	Codice 130-042-102
Kit di isolamento positivo CD4	Tecnologie per la vita	Codice 11331D