Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Generazione di NET
- Stimolare i neutrofili con 500 nM di PMA (per 30 ml di soluzione di neutrofili) e incubare su una piastra di coltura di tessuti piatti da 150 x 25 mm con una griglia di 20 mm per 4 ore a 37 °C 5% CO2. Ciò consentirà NETosis.
- Dopo 4 ore di stimolazione, aspirare delicatamente ed eliminare il terreno, lasciando lo strato di NET e neutrofili aderente sul fondo. Non interrompere questo livello.
- Utilizzando un totale di 15 ml di PBS freddo senza Ca e Mg per piastra, lavare il fondo di ogni piastra pipettando 15 ml di PBS sul fondo della piastra per sollevare tutto il materiale aderente dal fondo.
- Raccogliere la soluzione ottenuta dal lavaggio di ogni piatto (fase 1.3) in una provetta conica da 15 ml e centrifugare per 10 minuti a 450 x g a 4 °C. I neutrofili e le cellule rimanenti si riempiono di pellet sul fondo, lasciando un surnatante ricco di NET privo di cellule.
- Dividere il surnatante in provette per microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugare per 10 minuti a 18.000 x g a 4 °C. Ciò consentirà a tutto il DNA di pellettare.
nota: La centrifugazione in provette più grandi è più facile e richiede meno tempo se si possono raggiungere velocità così elevate con la centrifuga normale, altrimenti sarà necessario dividere i surnatanti in provette più piccole per utilizzare la microcentrifuga ad alta velocità.
- Scartare il surnatante e risospendere tutte le pastiglie ottenute insieme in PBS ghiacciato ad una concentrazione corrispondente a 2 x 107 neutrofili per 100 μl di PBS. In questo modo si otterrà il NET stock privo di cellule che può essere utilizzato per esperimenti successivi.
- Misurare la concentrazione di DNA nel campione ottenuto utilizzando la spettrofotometria o uno strumento di quantificazione del DNA alternativo. Una concentrazione adeguata nel campione dovrebbe essere compresa tra 140 e 180 ng/μl.
