Isolamento della rete di cellule immunitarie gengivali da blocchi di denti murini

In questo articolo

Abstract

Fonte: Dutzan, N. et al., Isolamento, caratterizzazione ed esame funzionale della rete di cellule immunitarie gengivali. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra la procedura di isolamento della rete di cellule immunitarie gengivali da un modello murino. La digestione enzimatica rilascia il tessuto gengivale dai denti e dall'osso attaccati, che viene ulteriormente digerito meccanicamente, liberando le cellule immunitarie dalla gengiva. Le cellule isolate sono pronte per esperimenti immunologici.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparati in anticipo

Preparare terreni completi: RPMI integrato con 2 mM di L-glutammina, 100 unità/ml di penicillina, 100 ug/ml di streptomicina e 10% di FBS.
Preparare i terreni DNasi: 50 ml di terreno RPMI integrati con 7,5 μg di DNasi (preparare fresco, tenere sempre in ghiaccio).
Preparare i terreni di Collagenasi-DNasi: 5 ml di terreni di DNasi più 3,2 mg/ml di Collagenasi di Tipo IV (preparare fresco, tenere sempre in ghiaccio).
Preraffreddare la centrifuga a 4 °C.
Incubatore con agitatore caldo a 37 °C.

2. Isolamento, dissezione e isolamento cellulare da blocchi gengivali

Sopprimere i topi esponendoli alla CO₂ in una camera appropriata, secondo le linee guida dell'Animal Research Advisory Committee (ARAC).
Aprire la cavità toracica e addominale per esporre il cuore e gli organi interni. Per perfondere, praticare un'incisione nella vena cava inferiore e perfondere 3 ml di PBS attraverso il ventricolo sinistro utilizzando una siringa da 3 ml con ago da 27 G.
Immobilizza il corpo e la testa del mouse su un tappetino con lo stomaco rivolto verso l'alto.
Taglia ogni commessura del labbro verso il collo con le forbici, separando la pelle che copre la mandibola e la regione del collo ed esponendo i tessuti e i muscoli sottostanti. Sezionare il labbro inferiore per scoprire la mandibola.
Tagliare tra gli incisivi inferiori per separare entrambi i lati della mandibola e immobilizzare ciascun lato per accedere alla cavità orale.
Visualizza e seziona il palato lontano dalla cavità nasale.
Sezionare le aree utilizzando una lama a 10 lame e includere le aree dei molari mascellari e mandibolari con la gengiva circostante (Figura 1). Praticare incisioni verticali appena anteriormente al primo molare e posteriormente al terzo molare e un'incisione orizzontale al bordo della gengiva (colletto bianco di tessuto che circonda i denti).
Posizionare i blocchi mascellare e mandibolare in un tubo conico da 50 ml con 5 ml di Collagenasi/DNasi (tenere in ghiaccio).
Incubare in un incubatore shaker a 37°C per 1 ora e durante gli ultimi 5 minuti di incubazione aggiungere 50 μl di EDTA 0,5 M.
Aggiungere 5 ml di terreno DNasi freddo nella provetta da 50 ml con i fazzoletti e agitare delicatamente per mescolare.
Trasferire i 4 blocchi di tessuto in una capsula di Petri e coprirli con 500 μl di terreno DNasi. Rimuovere la gengiva da ogni blocco di tessuto, utilizzando una lama di bisturi e puntando la lama nelle aree gengivali e interdentali.
Trasferire i tessuti e i terreni dalla capsula di Petri, nonché i precedenti terreni DNasi utilizzati durante la dissezione, in una nuova provetta da 50 ml attraverso il filtro cellulare (dimensione 70 μm). Lavare con DNase (3-5 ml) tutti gli strumenti utilizzati e filtrare.
Utilizzando lo stantuffo di una siringa sterile da 3 ml, schiacciare il fazzoletto contro il colino, filtrando con terreno DNasi freddo (da 30 a 35 ml).
Lavare il filtro cellulare con terreno DNasi freddo.
Centrifugare a 4 °C, 314 x g per 6 min.
Eliminare il surnatante e risospenderlo in 1 ml di terreno completo.
Contare le cellule (la quantità prevista deve variare tra 8 x 10⁵ e 1,2 x 10⁶ celle con una vitalità del >80%) utilizzando un contatore di celle automatizzato.

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Risultati

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Figura 1: Isolamento della gengiva murina. Illustrazione che dimostra i bordi di dissezione nella mascella e nel segmento gengivale isolato da utilizzare per la dissezione del tessuto gengivale. (B) Segmento della mascella murina (area molare) con un contorno per la dissezione del blocco e blocco isolato. La colorazione dell'ematossilina e dell'eosina (H&E) di un segmento molare mascellare con tessuti gengivali delineati è mostr...