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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Campioni di tessuto polmonare
NOTA: Per gli studi in vivo del tessuto polmonare, studiare i campioni dopo l'esposizione pertinente. L'esposizione più rilevante per questo esperimento è rappresentata dai microrganismi infettivi, in particolare dai batteri. I ceppi di topo che potrebbero essere utilizzati per questo metodo sono topi C57BL/6 o BALB/c, di età compresa tra 10 e 12 settimane, con un peso di 25-30 g e maschi.
- Eutanasia dei topi, tramite un'iniezione intraperitoneale di ketamina (400 mg/kg) e xilazina (40 mg/kg). Apri la cavità toracica ed esponi i polmoni e il cuore usando pinze chirurgiche e forbici.
- Infondere PBS caldo utilizzando un ago calibro 21 nel ventricolo destro per lavare via il sangue dai vasi per 30 s, quindi infondere 10 ml di fissativo PLP al 2% per 30 s (nel ventricolo destro).
- Utilizzare PBS caldo (42 °C) per lavare la cavità toracica aperta. Intubare la trachea con un ago calibro 21 e un pezzo di tubo da 0,8 mm tagliato a misura e iniettare 800 μl di soluzione di agarosio al 3% preriscaldata (a 42 °C) a basso punto di fusione.
- Lega la trachea con seta intrecciata (4.0 USP). Posiziona il filo intorno alla trachea, appena sotto il punto di inserimento della cannula, e fissalo con un semplice nodo a rovescio. Per solidificare l'agarosio, somministrare PBS ghiacciato intorno ai polmoni. Rimuovere i polmoni e il cuore come un blocco dalla cavità toracica usando sia le forbici che la dissezione smussata. Rimuovere ogni polmone singolarmente e fissarli per 16 ore in PLP al 2% o formalina a 4 °C.
- Conservare i campioni in PBS a 4 °C fino al sezionamento del tessuto.
- Per preparare i campioni di tessuto polmonare, attenersi alla seguente procedura.
- Fissare i tessuti polmonari (resecati al punto 1.1) in formalina tamponata naturale al 10% per 24 ore a temperatura ambiente. Trasferire in etanolo al 75% e mettere in un processatore tissutale con un ciclo di 12 ore (2,5 ore in EtOH al 75%, 3 ore in EtOH assoluto, 3,5 ore nel solvente 3B e 3 ore in paraffina).
- Incorporare in paraffina standard per creare blocchi fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) che vengono conservati a temperatura ambiente.
nota: In questa fase, è generalmente conveniente tagliare le sezioni polmonari per i vetrini standard.
- Tagliare le sezioni polmonari FFPE a uno spessore di 4 - 5 μm utilizzando un microtomo e montarle su vetrini caricati e rivestiti.
- Per montare i vetrini, mettere 3 gocce di supporto di montaggio su vetrini coprioggetti da 60 mm x 24 mm (misura 1,5), capovolgere il vetrino sul vetrino coprioggetti ed estrarre il supporto in eccesso. Sigillatele ermeticamente con lo smalto e conservatele a temperatura ambiente.
2. Preparazione/Microscopia di campioni di tessuto polmonare
- Per decerare, reidratare e pretrattare il campione di tessuto polmonare FFPE con una soluzione di recupero dell'antigene.
- Asciugare in forno gli scivoli FFPE per 60 minuti a 60 °C. Quindi mettere i vetrini in una soluzione di xilene per 30 minuti e trasferirli in una soluzione di etanolo al 70% per 5 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare con acqua di rubinetto.
- Mettere in un involucro di plastica resistente al calore e sottoporlo a recupero dell'antigene HIER in una pentola a pressione per 10 minuti in 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9.0. Raffreddare per 20 min. Lavare due volte in acqua di rubinetto per 5 minuti su un bilanciere, poi una volta con PBS su un bilanciere.
- Bloccare con il 10% di siero di pollo al 5% di BSA/PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Macchia il tessuto.
- Per definire i MET nei macrofagi, aggiungere anticorpi primari (MMP-9, H3Cit e F4/80) in BSA/PBS all'1% per 16 ore a 4 °C a 1/100 di diluizione (i dettagli specifici sulle quantità di anticorpi sono elencati nella Tabella dei materiali). Lavare due volte con PBS per 5 minuti su un bilanciere.
- Ottenere la rilevazione fluorescente mediante incubazione con gli anticorpi secondari corrispondenti in BSA/PBS all'1% per 40 minuti a temperatura ambiente. Gli anticorpi sono: (1) pollo anti-topo 488 (verde), (2) pollo anti-capra 594 (rosso) e (3) asino anti-topo 647 (lontano rosso).
- Lavare le sezioni in PBS e montarle con un mezzo di montaggio contenente DAPI per la colorazione della cromatina.
- Ottenere immagini fluorescenti utilizzando una testina di scansione laser confocale collegata a un microscopio invertito.
- Eccita la preparazione con laser a 405, 488, 561 e 647 nm. Acquisisci immagini su un singolo piano da 512 x 512 pixel facendo clic sul pulsante di livellamento sequenziale in linea (media di 2 linee) utilizzando obiettivi 20X 0,1 NA aria e 40X 1,0 NA olio.
- Ottenere almeno dieci campi visivi per sezione per l'analisi e i dati per ciascun risultato (ad esempio, 10 campi visivi ad alta potenza (HFOV) per il controllo, 10 per il campione stimolato, ecc., per ciascun topo).
nota: Per ottenere un campione rappresentativo dell'intero campo, è possibile utilizzare un sistema a matrice in cui il campo è diviso in diverse sezioni, e per ogni diverso campione la stessa matrice viene utilizzata per selezionare i campi di vista (ad esempio, il campo può essere diviso in 9 sezioni, e dal centro e dai 4 angoli, due HFOV sono presi).