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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
NOTA: Un flusso schematico del metodo è descritto nella Figura 1.
1. Preparazione del materiale
NOTA: Preparare tutti i reagenti in modo asettico in una cappa sterile, aliquotare e conservare alla temperatura indicata. I reagenti possono essere conservati fino a 2 anni senza perdere il loro effetto.
- Preparare CFA contenente 20 mg/mL di Mycobacterium tuberculosis come descritto di seguito.
- Aggiungere 100 mg di M. tuberculosis liofilizzato H37RA (vedere la Tabella dei materiali) e cinque perline di acciaio da 3,2 mm in una provetta da 7 ml (vedere la Tabella dei materiali). Agitare il tubo in un omogeneizzatore (vedere la tabella dei materiali) per 60 s alla massima velocità (5.000 giri/min).
- Aggiungere 5 mL di adiuvante di Freund incompleto (IFA) alla provetta e agitare nuovamente per 60 s alla massima velocità. Trasferire il liquame di M. tuberculosis omogeneizzato in IFA (ora chiamato CFA) in una provetta nuova con una pipetta, lasciando le perle, e conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
- Aggiungere acqua ultrapura alla polvere liofilizzata del peptide MOG35-55 (vedere la Tabella dei materiali) per ottenere una concentrazione finale del peptide di 10 mg/mL. Sterilizzare la soluzione facendola passare attraverso un filtro da 0,2 μm. Preparare aliquote da 60 μl e conservare a -20 °C fino al momento dell'uso.
nota: Il peptide MOG35-55 utilizzato per questo esperimento è di purezza ImmunoGrade (~70%), è scisso in TFA, si dissolve facilmente in acqua e contiene un'ammide C-terminale (-NH2) per aumentare la stabilità in vivo. Le aliquote di peptidi non sono mai state scongelate e ricongelate più di due volte e sono state conservate a -20 °C fino all'uso.
2. Preparazione di emulsioni CFA/peptidiche
- Calcolare la quantità di emulsione necessaria per l'immunizzazione. In questo protocollo standard, ogni topo riceve 50 μg di peptide MOG35-55 e 300 μg di M. tuberculosis dispersi nell'adiuvante di Freund (CFA). La quantità di ciascun reagente (peptide MOG35-55, PBS, CFA e IFA) necessaria per la preparazione delle emulsioni può essere calcolata utilizzando il file supplementare 1. Un ulteriore 20% di tutti i reagenti, per compensare la piccola perdita di emulsione, è incluso nel calcolo.
nota: Il kit di emulsione commerciale (vedi Tabella dei materiali) utilizzato in questo studio comprende un tubo, un tappo a vite e uno stantuffo in una busta sterilizzata. Ogni provetta del kit di emulsione contiene un massimo di 9,6 ml, rendendo possibile la preparazione di 8 siringhe da 1 ml sufficienti per immunizzare 40 topi (o 80 topi se si utilizzano 100 μl di emulsione per animale).
- Posizionare il tubo con tappo a vite (dal kit di emulsione in commercio) e i reagenti da utilizzare sul ghiaccio.
- Aggiungere i componenti dell'emulsione nel seguente ordine nei volumi calcolati al punto 2.1: PBS, quindi il peptide, quindi M. tuberculosis in CFA e infine IFA.
- Chiudere saldamente il tubo con il tappo stringendolo e allentandolo più volte. Agitare energicamente la provetta per 5-10 s a mano per premiscelare i reagenti.
- Posizionare il tubo nell'omogeneizzatore di agitazione e fissarlo con l'asta. Impostare la velocità al massimo e il tempo a 60 s. Una volta terminata la corsa, posizionare il tubo sul ghiaccio per 3 minuti. Ripetere la corsa una o due volte con le stesse impostazioni.
- Centrifugare la provetta a 300 x g per 1 minuto per rimuovere l'aria intrappolata e compattare l'emulsione.
- Rimuovere il tappo dal tubo, inserire lo stantuffo nel tubo e spingerlo lentamente verso il basso fino a raggiungere la parte superiore dell'emulsione. Rimuovere la chiusura a scatto sul fondo del tubo ruotandola.
- Rimuovere lo stantuffo da una siringa per iniezione (1 mL; vedere Tabella dei materiali). Aggiungere un ago (preferibilmente 25-27 G) alla siringa per iniezione.
- Collegare l'estremità posteriore della siringa per iniezione all'apposito blocco nella parte inferiore del tubo e bloccarla con una breve rotazione.
- Trasferire l'emulsione dal tubo alla siringa per iniezione spingendo delicatamente lo stantuffo. Arrestare quando l'emulsione raggiunge la graduazione di 0,15 mL della siringa per iniezione.
- Separare la siringa per iniezione dal tubo e inserire lo stantuffo con cautela, facendo attenzione che l'aria non penetri nella siringa. Spingere lo stantuffo fino a quando l'emulsione non fuoriesce dall'ago.
nota: A questo punto, una parte dell'emulsione può essere utilizzata per il controllo qualità (vedi passaggio 3).
- Ripetere i passaggi 2.8-2.11 per il resto dell'emulsione presente nel tubo.
nota: Per ridurre al minimo lo spreco di costose emulsioni di CFA/antigene, è necessario utilizzare siringhe da 1 mL. Possono essere utilizzate altre siringhe che si adattano all'apposito blocco sul fondo del tubo; Tuttavia, potrebbe essere necessario preparare un volume maggiore di emulsione. L'emulsione peptidica CFA/MOG35-55 può essere conservata a 4 °C per un massimo di 15 settimane senza perdere la sua capacità di indurre EAE.
3. Controllo di qualità dell'emulsione
- Test di caduta: Aggiungere una piccola goccia di emulsione in una provetta conica sterile da 50 ml riempita con 20 ml di acqua fredda. Chiudere il tubo e agitarlo a mano per un paio di secondi. La comparsa di minuscole goccioline distinte conferma la formazione di un'emulsione acqua-in-olio.
- Esaminare l'emulsione utilizzando la microscopia a contrasto di fase.
- Per analizzare le dimensioni delle particelle di acqua nell'olio, aggiungere una minuscola goccia (2-3 μL) di emulsione a un vetrino da microscopio, spalmarla con un vetrino coprioggetti e quindi spingere con forza con un movimento circolare per appiattire l'emulsione.
- Esaminare l'emulsione spalmata al microscopio a contrasto di fase (vedere Tabella dei materiali) con ingrandimento 400x e mettere a fuoco un campo con un monostrato dell'emulsione. Assicurarsi che siano visibili piccole particelle uniformi di colore grigio/bianco (Figura 2A).
