Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione del mouse
NOTA: La seguente procedura, compresa la preparazione e la chirurgia degli animali, richiederà 30-40 minuti. Prima dell'intervento, accendere il microscopio e riscaldare l'incubatrice in dotazione al microscopio a 37 °C.
- Eseguire esperimenti su topi TcrdEGFP di 8-10 settimane su un background C57BL/6, ottenuti da Bernard Malissen (INSERM, Parigi, Francia). Secondo la procedura approvata dall'IACUC, anestetizzare il topo mediante iniezione endovenosa di ketamina (120 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) in base al peso dell'animale. Valutare il livello di anestesia in base alla frequenza respiratoria (55-65 respiri al minuto), al pizzicamento delle dita dei piedi e al riflesso palpebrale.
- Una volta raggiunta l'anestesia sul piano chirurgico, fissare le zampe posteriori del topo con del nastro adesivo a un termoforo per mantenere la temperatura corporea, che può essere monitorata da un termometro rettale. Se ci sono segni che l'anestesia sta svanendo (ad esempio, aumento della frequenza respiratoria, ammiccamento e/o risposta alle contrazioni dei muscoli oculari al riflesso palpebrale), somministrare nuovamente 50 μL di ketamina/xilazina alla volta fino a quando il topo non è completamente sedato.
- Preparare il colorante nucleare diluendo 50 μl di Hoechst 33342 (10 mg/mL) con 315 μl di soluzione fisiologica allo 0,9%; la concentrazione finale è di 37,5 mg/kg in base al peso del topo (200 μl di volume approssimativo). Una volta che il topo è anestetizzato, iniettare lentamente l'Hoechst utilizzando una siringa di tubercolina attraverso il seno venoso retro-orbitale.
NOTA: Attendere 1-2 minuti prima di procedere al passaggio successivo per consentire al topo di acclimatarsi alla variazione del volume circolante dopo l'iniezione retroorbitale.
- Metti una piccola quantità di lubrificante sugli occhi per evitare che si secchino.
2. Chirurgia del topo: laparotomia per esporre la mucosa intestinale
- Praticare un'incisione verticale di 2 cm attraverso la pelle e il peritoneo lungo la linea mediana del basso addome per esternalizzare la regione dell'intestino da riprendere.
- Utilizzando una pinza angolata, estrarre con cautela il cieco dalla cavità peritoneale e identificare l'area dell'intestino tenue da visualizzare. Fare attenzione a non strappare i vasi sanguigni mesenterici durante questo processo. Per ridurre al minimo potenziali danni o sanguinamento, evitare di afferrare o pizzicare l'intestino con il forcipe.
- Individuare una regione adatta dell'intestino tenue (2-3 cm) per l'imaging che contenga un contenuto fecale minimo. Rimettere con cura il cieco e l'intestino tenue rimanente nella cavità peritoneale, lasciando esternalizzato il segmento di interesse.
NOTA: Evitare di perforare il cieco o di interrompere il sistema vascolare mesenterico durante questo passaggio.
- Posizionare due paia di pinze su entrambi i lati del mesentere sottostante tra i vasi sanguigni e strofinare delicatamente le punte delle pinze insieme per creare un foro nella membrana (Figura 1). Ciò consentirà all'ago di passare attraverso il mesentere quando si chiude la cavità peritoneale sotto l'intestino.
- Chiudere l'incisione mantenendo l'ansa dell'intestino esternalizzata. Utilizzando una pinza angolata e un ago curvo a punta conica attaccato a una sutura di 5 cm, penetrare da un lato del peritoneo, passare attraverso il foro praticato nel passaggio precedente e risalire attraverso l'altro lato del rivestimento peritoneale. Posizionare una sutura in alto e un'altra vicino alla parte inferiore dell'incisione.
NOTA: Evitare di danneggiare il sistema vascolare durante questo passaggio.
- Ripetere questo processo per chiudere la pelle sotto l'ansa intestinale, posizionando una sutura al centro dell'incisione, tra le suture precedenti nel peritoneo sottostante><.
NOTA: È importante esternalizzare solo l'area che deve essere ripresa; Ciò ridurrà il movimento estraneo durante l'imaging. Assicurati di evitare di legare le arterie mesenteriche.
- Utilizzare un elettrocauterizzazione per tracciare una linea di perforazione lungo il bordo anti-mesenterico. Immediatamente dopo la cauterizzazione, applicare alcune gocce d'acqua sulla superficie dell'intestino per prevenire ulteriori danni ai tessuti indotti dal calore. Tamponare con un Kimwipe per rimuovere l'acqua residua.
- Tagliare una piccola fessura orizzontale sul bordo distale del tessuto cauterizzato utilizzando le forbici di Vannas e procedere al taglio lungo la lunghezza della linea cauterizzata verso l'estremità prossimale del segmento di tessuto esternalizzato (circa 1,5 cm di lunghezza) per esporre la superficie della mucosa.
NOTA: Se necessario, utilizzare una pinza per rimuovere delicatamente il contenuto fecale in eccesso rimasto sulla superficie della mucosa esposta.
- Copri l'addome del topo con un Kimwipe umido per evitare che il tessuto si disidrati. Trasportare il mouse al microscopio in un recipiente coperto.
3. Acquisizione di immagini mediante microscopia confocale a disco rotante
- Pipettare 150 μL di AlexaFluor 633 da 1 μM in HBSS sul fondo di vetro di una capsula da 35 mm. Posizionare il mouse in modo che la superficie mucosa aperta entri in contatto diretto con il vetrino coprioggetti.
- Inclinare all'indietro la testa del microscopio e posizionare il mouse sul piatto di copertura sul tavolino di imaging in un'incubatrice preriscaldata. In alternativa, copri il topo con una coperta riscaldante per mantenere la temperatura corporea.
- Avvia il software di imaging. L'intensità di eccitazione e il tempo di esposizione per ciascun laser non devono superare rispettivamente i 10-15 mW o i 120-150 ms, per evitare il fotobleaching e ridurre al minimo l'intervallo tra i punti temporali. Regolare la media dei fotogrammi su "2" e attivare la funzione di guadagno EM per ridurre il rumore di fondo. Selezionare la calibrazione dell'obiettivo 63x per garantire la corretta misurazione della dimensione dei pixel.
NOTA: Le impostazioni descritte sopra hanno lo scopo di fornire un riferimento iniziale, ma variano a seconda delle configurazioni dei singoli microscopi.
- Utilizzando il laser a 405 nm e l'obiettivo ad aria 20x, visualizza i nuclei per individuare un campo di villi che mancano di movimento evidente o si spostano a occhio. Evitare le aree di movimento artefatto dovute alla respirazione, alla peristalsi o al battito cardiaco.
- Utilizzando la scansione XY, registrare le coordinate XY del campo di interesse e passare all'obiettivo 63X ad immersione in glicerolo.
- Verificare che i villi nel campo selezionato siano stabili acquisendo un'immagine dal vivo sul canale a 405 nm per un massimo di 1 minuto.
- Durante l'acquisizione di un'immagine dal vivo sul canale a 405 nm, regolare la messa a fuoco per trovare il piano ortogonale appena sotto la punta del villo. Acquisire Z-stack partendo da appena sotto l'epitelio della punta villosa lungo i villi fino a quando non è difficile risolvere i nuclei, circa 15-20 μm, utilizzando un passo di 1,5 μm.
NOTA: Quando si esegue l'imaging con tre canali (405, 488, 640 nm) utilizzando i tempi di esposizione descritti sopra, è possibile acquisire tutti e tre i canali in sequenza a intervalli di circa 20 s.
- Aprire il software in modalità di analisi, 3-5 minuti dopo l'inizio dell'acquisizione, per confermare la stabilità dell'immagine e la motilità γδ IEL. Continuare ad acquisire immagini per 30-60 minuti per ogni campo di villi. Registra 2-3 campi per ogni mouse. Durante l'imaging, monitorare il mouse ogni 5 minuti.
