Isolamento di microparticelle derivate da linfociti T apoptotici in vitro

Abstract

Fonte: Yang, C. et al., Generazione di microparticelle linfocitiche e rilevamento del loro effetto proapoptotico sulle cellule epiteliali delle vie aeree. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video dimostra la generazione e l'isolamento di microparticelle derivate dai linfociti T, LMP, dai linfociti T dopo il trattamento con actinomicina-D.

Protocollo

1. Produzione e caratterizzazione di LMP

NOTA: Per prevenire la contaminazione, assicurati che tutti i materiali utilizzati in questo esperimento siano sterili o sterilizzati in autoclave. Eseguire tutti i passaggi di RT in una cabina di sicurezza biologica in condizioni sterili, se non diversamente indicato.

1. Stimolazione e raccolta di MP
   1. Scongelare un'aliquota di 10 milioni di cellule T CEM in un bagno d'acqua a 37 °C. Diluire in 10 ml di terreno ematopoietico preriscaldato privo di siero come X-VIVO, in una provetta sterile da 15 ml e centrifugare a 200 g x 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in un terreno preriscaldato da 5 ml.
   2. Trasferire le cellule in un pallone di coltura tissutale T75 (per le cellule in sospensione) con 15 ml di terreno ematopoietico preriscaldato come X-VIVO e incubare per 4 giorni in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂.
   3. Dopo 4 giorni, trasferire tutto il terreno di coltura e le cellule in un pallone di coltura tissutale T175 contenente 100 ml di terreno fresco. Continuare a incubare le cellule per circa 72 ore nelle stesse condizioni fino a quando non sono cresciute fino a raggiungere una densità di 2 milioni di cellule/ml.
   4. Dividere uniformemente le cellule in quattro fiasche T175 contenenti ciascuna 150 ml di terreno fresco e continuare la coltura cellulare fino a quando le cellule non sono cresciute (circa 48 ore di incubazione) fino a raggiungere una densità di 2 milioni/ml.
   5. Raccogliere le cellule da ciascun pallone mediante centrifugazione a 200 x g per 5 minuti e risospendere 300 x 10⁶ cellule in un nuovo pallone T175 contenente 150 ml di terreno fresco, per mantenere la densità cellulare di 2 milioni/ml.
   6. Aggiungere actinomicina D (disciolta in DMSO a 2 mg/ml) al terreno a una concentrazione finale di 0,5 μg/ml e incubare per 24 ore.
   7. Trasferire tutto il terreno di coltura in provette coniche da 50 ml e centrifugare le cellule a 750 x g per 5 minuti. Trasferire il surnatante in provette coniche da 50 ml e centrifugare a 1.500 x g per 15 minuti per rimuovere i frammenti cellulari di grandi dimensioni.
   8. Trasferire il surnatante in un flacone da 250 ml e centrifugare a 12.000 x g per 50 min. Scartare il surnatante e raccogliere i pellet.
   9. Lavare i pellet arricchiti con LMP con 40 ml di PBS sterile in una provetta da 50 ml mediante centrifugazione a 12.000 x g per 50 minuti. Ripetere questo passaggio due volte.
   10. Raccogli l'ultimo surnatante di lavaggio; verrà utilizzato come controllo del veicolo. Sospendere i pellet LMP in 1 ml di PBS e trasferirli in una microprovetta sterile da 1,5 ml. Aliquotare e conservare le LMP isolate a -80 °C (per evitare più cicli di scongelamento libero).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cellule T CEM	ATCC	CCL-119
X-VIVO 15 medio	Cambrex, città della Provincia di Walkersville	04-744Q
Pallone T75	Sarstedt	83.1813.502
Pallone T175	Sarstedt	83.1812.502
Actinomicina D	Sigma Chemical Co.	A9415-2 mg
Pbs	Tecnologie di vita	Codice 14190-144
Filtro da 0,22 μm	Sarstedt	83.1826.001
Incubatore cellulare	Mandel	Heracell 150
Centrifuga a bassa velocità	Iec	Centra8R
Centrifuga ad alta velocità	Beckman	Avanti J8
Rotore ad alta velocità per flacone da 250ml	Beckman	JLA16.250
Rotore ad alta velocità per tubo da 50ml	Beckman	JA30.50