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1. Produzione e caratterizzazione di LMP
NOTA: Per prevenire la contaminazione, assicurati che tutti i materiali utilizzati in questo esperimento siano sterili o sterilizzati in autoclave. Eseguire tutti i passaggi di RT in una cabina di sicurezza biologica in condizioni sterili, se non diversamente indicato.
- Stimolazione e raccolta di MP
- Scongelare un'aliquota di 10 milioni di cellule T CEM in un bagno d'acqua a 37 °C. Diluire in 10 ml di terreno ematopoietico preriscaldato privo di siero come X-VIVO, in una provetta sterile da 15 ml e centrifugare a 200 g x 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in un terreno preriscaldato da 5 ml.
- Trasferire le cellule in un pallone di coltura tissutale T75 (per le cellule in sospensione) con 15 ml di terreno ematopoietico preriscaldato come X-VIVO e incubare per 4 giorni in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2.
- Dopo 4 giorni, trasferire tutto il terreno di coltura e le cellule in un pallone di coltura tissutale T175 contenente 100 ml di terreno fresco. Continuare a incubare le cellule per circa 72 ore nelle stesse condizioni fino a quando non sono cresciute fino a raggiungere una densità di 2 milioni di cellule/ml.
- Dividere uniformemente le cellule in quattro fiasche T175 contenenti ciascuna 150 ml di terreno fresco e continuare la coltura cellulare fino a quando le cellule non sono cresciute (circa 48 ore di incubazione) fino a raggiungere una densità di 2 milioni/ml.
- Raccogliere le cellule da ciascun pallone mediante centrifugazione a 200 x g per 5 minuti e risospendere 300 x 106 cellule in un nuovo pallone T175 contenente 150 ml di terreno fresco, per mantenere la densità cellulare di 2 milioni/ml.
- Aggiungere actinomicina D (disciolta in DMSO a 2 mg/ml) al terreno a una concentrazione finale di 0,5 μg/ml e incubare per 24 ore.
- Trasferire tutto il terreno di coltura in provette coniche da 50 ml e centrifugare le cellule a 750 x g per 5 minuti. Trasferire il surnatante in provette coniche da 50 ml e centrifugare a 1.500 x g per 15 minuti per rimuovere i frammenti cellulari di grandi dimensioni.
- Trasferire il surnatante in un flacone da 250 ml e centrifugare a 12.000 x g per 50 min. Scartare il surnatante e raccogliere i pellet.
- Lavare i pellet arricchiti con LMP con 40 ml di PBS sterile in una provetta da 50 ml mediante centrifugazione a 12.000 x g per 50 minuti. Ripetere questo passaggio due volte.
- Raccogli l'ultimo surnatante di lavaggio; verrà utilizzato come controllo del veicolo. Sospendere i pellet LMP in 1 ml di PBS e trasferirli in una microprovetta sterile da 1,5 ml. Aliquotare e conservare le LMP isolate a -80 °C (per evitare più cicli di scongelamento libero).