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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Arricchisci le cellule T CD8+ specifiche per l'antigene con cellule artificiali che presentano l'antigene con nanoparticelle preparate.
- Isolare le cellule T CD8+.
- Eutanasia degli animali mediante esposizione all'isoflurano seguita da lussazione cervicale.
- Rimuovere la milza e i linfonodi dai topi C57BL/6j wild-type e metterli in una soluzione di PBS. Macerare gli organi ed eluire le cellule attraverso un colino cellulare sterile da 70 μm con frequenti lavaggi di PBS.
- Per eliminare le cellule T non CD8+, utilizzare un kit di isolamento delle cellule T CD8+ no-touch e seguire le istruzioni del produttore.
NOTA: Ogni condizione dell'antigene richiede almeno 3 x 106 cellule T CD8+.
- Aggiungi le nanoparticelle aAPC per legarsi alle cellule T CD8+.
- Dopo l'isolamento, concentrare a un volume di 100 μl in PBS con albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5% e 2 mM di EDTA.
- Determinare il numero di aAPC da aggiungere calcolando in base al rapporto di 1011 MHC-Ig legate ad aAPC e caricate con peptidi per ogni 106 cellule T CD8+.
- Incubare le particelle aAPC e le cellule T CD8+ per 1 ora a 4 °C mescolando continuamente in una provetta sterile da 5 mL di polistirene a fondo tondo.
- Preparare terreni integrati e fattore di crescita delle cellule T (TCGF) per eluire e coltivare le cellule T CD8+.
- Per i terreni integrati, integrare i terreni RPMI 1640 completi (con glutammina) con 1 amminoacido non essenziale, 1 mM di piruvato di sodio, 0,4 di soluzione vitaminica, 92 μM di 2-mercaptoetanolo, 10 μM di ciprofloxacina e il 10% di siero fetale bovino (FBS).
- Per creare TCGF, segui i protocolli stabiliti.
nota: Il TCGF è un cocktail interno di citochine immunitarie umane che è essenziale per fornire alle cellule T ulteriori segnali di stimolazione necessari per crescere. Il TCGF potrebbe essere sostituito con note citochine stimolanti delle cellule T come IL-2, IL-7 o IL-15; tuttavia, ciascuno può polarizzare di conseguenza la risposta delle cellule T.
- Lavare e arricchire la miscela di cellule T aAPC e CD8+.
- Lavare le aAPC delle particelle magnetiche, in primo luogo utilizzando il tampone PBS con BSA allo 0,5% e 2 mM di EDTA, in secondo luogo utilizzando terreni integrati e in terzo luogo utilizzando terreni integrati con TCGF all'1%.
- Eluire le aAPC e le cellule T CD8+ arricchite in 500 μL di terreno integrato con l'1% di TCGF.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e una piastra in una piastra con fondo a U da 96 in 160 μL per pozzetto di terreno integrato con TCGF all'1% a una concentrazione di 2,5 x 105 cellule T CD8+/mL.
- Se si esegue l'isolamento utilizzando aAPC con solo MHC-Ig caricate con peptidi sulla superficie (nessun segnale co-stimolatorio), completare il passaggio 4.5. Se si isola utilizzando aAPC con MHC-Ig caricato con peptidi sulla superficie e segnali co-stimolatori, procedere al passaggio 5.
- Aggiungere le particelle magnetiche rivestite con segnali co-stimolatori sulla superficie alla frazione arricchita e aggiungere un campo magnetico per raggruppare i segnali stimolatori sulla superficie delle cellule T.
- Alle frazioni arricchite, aggiungere un anticorpo stimolante equimolare (o superiore a seconda dell'applicazione, vedere la sezione sulle proprietà dell'aAPC per controllare) al numero di MHC-Ig caricate con peptidi sulla particella.
- Lasciare che le particelle magnetiche co-stimolatrici si leghino alle cellule T CD8+ arricchite per 1 ora a 4 °C.
- Aggiungi un campo magnetico posizionando la piastra di coltura tra due dischi magnetici al neodimio N52 di 1,9 cm (0,75 pollici) di lunghezza.
nota: I dischi magnetici N52 hanno un campo estremamente forte. Bisogna fare attenzione sia a conservarli con distanziatori tra i magneti, poiché è difficile rimuoverli l'uno dall'altro quando li si mette sulle piastre di coltura. Per ridurre al minimo l'adesione dei magneti ai componenti metallici dell'incubatrice, posizionarli in contenitori di polistirolo in provetta conica da 50 ml sia sul fondo che sulla parte superiore.
2. Espandi e rileva le cellule T CD8+ specifiche per l'antigene con cellule artificiali che presentano l'antigene con nanoparticelle preparate
- Aggiungere la piastra a 96 pozzetti con fondo a U con aAPC e cellule T CD8+ in un incubatore umidificato al 5% di CO2, 37 °C per 3 giorni. Il giorno 3, alimentare le cellule con 80 μl per pozzetto di terreno integrato con TCGF al 2% e rimetterle nell'incubatore fino al giorno 7.
- Il giorno 7, raccogliere le cellule stimolate in una provetta a fondo tondo da 5 mL per il conteggio.
- Una volta raccolta tutta la soluzione, centrifugare le cellule raccolte per risospendere in 0,5 mL di PBS con lo 0,05% di sodio azide e il 2% di FBS. Contare le cellule vitali colorando con blu di tripano e contando su un emocitometro.
- Rimuovere 50.000-500.000 cellule contate in due nuove provette a fondo tondo da 5 mL per la colorazione antigene-specifica. Una provetta verrà utilizzata per la colorazione peptide-MHC affine e l'altra provetta verrà utilizzata per la colorazione non affine per determinare la colorazione di fondo.
- Aggiungere 1 μg di MHC-Ig biotinilata alle rispettive provette affini e non affini in 100 μl di PBS con sodio azide allo 0,05% e FBS al 2% con CD8a di ratto coniugato con alloficocianina (APC), clone 53-6,7 (rapporto di diluizione di 1:100) per 1 ora a 4 °C.
- Aggiungere streptavidina secondaria e macchia morta viva. Lavare via l'eccesso di MHC-Ig biotinilata con PBS attraverso la centrifugazione. Quindi colorare tutti i campioni con un rapporto 1:350 di streptavidina marcata con ficoeritrina (PE) e un rapporto 1:1000 di una colorazione di cellule morte verdi vivi/morte fissabili per 15 minuti a 4 °C.
- Leggere tutti i campioni su un citometro a flusso per determinare la specificità e il numero di cellule antigene-specifiche.
- Lavare via le macchie secondarie e vive/morte in eccesso mediante centrifugazione e risospendere con 150 μL di tampone PBS con sodio azide allo 0,05% e FBS al 2% da leggere su un citometro a flusso.
- Determina il numero e la percentuale di cellule antigene-specifiche con il software di analisi dei dati.
- Per determinare la percentuale di cellule antigene-specifiche, utilizzare le seguenti porte nel rispettivo ordine live+, linfociti+ (diffusione diretta per diffusione laterale), CD8+ e Dimer+. Determinare il cancello Dimer+ confrontando la colorazione non affine con quella affine.
- Determinare la percentuale di cellule antigene-specifiche in un campione sottraendo la percentuale di Dimer+ della colorazione MHC-Ig affine dalla colorazione MHC-Ig non affine.
- Utilizzando questa percentuale di cellule antigene-specifiche, moltiplicarla per il numero di cellule contate, ottenendo il numero di cellule antigene-specifiche risultanti dall'arricchimento e dall'espansione.
nota: La compensazione dovrà essere impostata sul citometro a flusso poiché vi è una sovrapposizione spettrale con i fluorofori utilizzati in questo pannello.