Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento PMC mediante lavaggio intraperitoneale
- Prima dell'isolamento cellulare, preparare i materiali elencati nella Tabella 1.
- Utilizzare topi maschi di età compresa tra 8 e 14 settimane per l'isolamento PMC. Eutanasia di un topo per inalazione di CO2 e confermare la morte per perdita di riflessi. Spruzzare il mouse con etanolo al 70% e fissarlo su un blocco di schiuma usando degli spilli (lato dorsale rivolto verso il basso). Rimuovere la pelle ventrale del mouse usando le forbici smussate. Evitare di danneggiare la cavità peritoneale.
nota: Utilizziamo tipicamente questo protocollo per i topi con un background genetico di ceppo C57BL/6N.
- Iniettare 7 ml di terreno RPMI ghiacciato e 5 ml di aria nella cavità peritoneale utilizzando una siringa da 10 ml dotata di ago da 27 G. Spingere con cautela l'ago nel peritoneo e non perforare alcun organo. Utilizzare un punto nella regione del grasso dell'epididimo per ridurre il rischio di perforazione degli organi.
- Dopo l'iniezione, agitare il topo per 1 minuto per staccare le cellule peritoneali nel terreno RPMI. Non scuotere il topo troppo forte, per evitare di danneggiare gli organi interni e contaminare la cavità peritoneale con il sangue.
- Riutilizzare la siringa da 10 ml dotandola di una nuova cannula da 20 G. Sposta gli organi interni da un lato inclinando il blocco di schiuma e picchiettandolo delicatamente sul banco per facilitare l'aspirazione media dall'altro lato. Inserire un ago da 20 G, smussare verso l'alto e aspirare il fluido dall'addome delicatamente e lentamente (~0,5 ml/s) per evitare l'ostruzione da parte degli organi interni. Raccogliere quanto più liquido possibile (in genere 5-6 ml).
- Rimuovere l'ago dalla siringa e trasferire la sospensione cellulare raccolta in una provetta di raccolta con ghiaccio. Gettare una provetta del campione se c'è una contaminazione visibile del sangue.
- Centrifugare le provette con la sospensione cellulare a ~300 x g per 5 minuti. Sotto una cappa sterile aspirare il surnatante. Per ogni topo, combinare i pellet di campione in 4 mL di terreno PMC freddo (4-10 °C) e trasferire la sospensione cellulare in un pallone di coltura da 25 cm2. Aggiungere i fattori di crescita IL-3 e SCF alle concentrazioni finali di 10 ng/mL e 30 ng/mL, rispettivamente. Mettere il pallone contenente le cellule in un incubatore (37 °C e 5% CO2) e incubare per ~48 ore fino alla procedura successiva.
Tabella 1: Materiali per il passaggio 1.
| 1 | ghiaccio |
| numero arabo | Siringhe da 10 mL |
| 3 | Ferri da 27 g |
| 4 | Ferri da 20 g |
| 5 | Blocco e perni in polistirolo |
| 6 | Provette di raccolta (provette da centrifuga in plastica da 50 mL) |
| 7 | 70% etanolo |
| 8 | RPMI Medium (Pre refrigerato e conservato in ghiaccio) |
| 9 | PMC Medium: RPMI Medium + 20% FCS (siero fetale di vitello) + 1% penicillina e streptomicina (Pen-Streptomyc) |
| 10 | Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco - DPBS (senza Ca2+ e Mg2+) |
| 11 | Fiasche di coltura (25 cm) |
| 12 | Fattori di crescita soluzioni stock (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL) |
| 13 | Pipette sierologiche (10 mL) |
| 14 | Puntali per pipette sterili (20-200 μl) |
| 15 | Emocitometro |
| 16 | Centrifuga da banco |
| 17 | Forbici e pinze |
| 18 | Camera CO2 per topi |
| 19 | Aprire il cappuccio sterile |
| 20 | Cappuccio sterile chiuso |
| 21 | Incubatore cellulare (37 °C e 5% CO2) |
| 22 | Pipette di trasferimento (20-200 μl) |