Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Fabbricazione di dispositivi e litografia morbida
NOTA: Sono state utilizzate tecniche standard di litografia morbida per creare il microcanale del polidimetilsilossano (PDMS).
- Miscelare il precursore PDMS in un rapporto 10:1 tra base e agente indurente.
- Versare 30 g della miscela di precursori PDMS nello stampo di alluminio microlavorato (vedere la Figura 1 per le dimensioni) e 20 g di miscela di precursori PDMS nella piastra di Petri da 100 mm.
nota: La piastra di Petri viene utilizzata per realizzare il film spesso di PDMS (~3 mm) per lo strato di supporto. Lo strato di supporto del PDMS fornisce proprietà fisiche superficiali uniformi in tutta la microfluidica. In alternativa, è possibile utilizzare una sottile pellicola PDMS sul vetrino. Lo stampo master con dimensioni specifiche del canale è stato progettato e realizzato mediante microfresatura sulla lamiera di alluminio. Il canale a spirale utilizzato in questo studio era un microcanale a spirale a 8 anelli con un ingresso e due uscite, con il raggio che aumentava da 8 mm a 24 mm per un'efficiente separazione basata sulle dimensioni.
- Posizionare lo stampo e la capsula di Petri in un essiccatore sottovuoto per degassare fino a quando non sono visibili bolle sulla superficie, in genere 5 - 10 minuti. Utilizzare un aspirapolvere domestico per l'essiccatore.
- Rilasciare il vuoto e mettere lo stampo e la capsula di Petri in forno a 90 °C per 1 h.
nota: Al posto del forno è possibile utilizzare una piastra riscaldante o altri strumenti di riscaldamento.
- Togliete lo stampo e la pirofila dal forno e lasciatela raffreddare a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Ritagliare con cura il contorno e perforare i fori di accesso al fluido sul dispositivo utilizzando un perforatore da 2 mm.
nota: La dimensione del punzone può variare a seconda delle dimensioni del tubo o della guida del fluido.
- Far aderire un nastro adesivo al lato del canale del dispositivo e una spessa pellicola di PDMS e staccare accuratamente con una pinza per rimuovere la polvere.
- Trattare sia il lato del canale del dispositivo che il PDMS semplice con plasma ad aria e incollare con lo strato di supporto preparato del PDMS semplice (Figura 1A).
- Posizionare il chip sul vetrino da 50 mm x 70 mm e metterlo in forno a 70 °C per almeno 30 minuti per aumentare la forza di adesione.
2. Raccolta delle secrezioni tracheali da pazienti ventilati meccanicamente
NOTA: Le secrezioni tracheali possono essere ottenute da pazienti ventilati meccanicamente durante la normale cura di routine delle vie aeree utilizzando un protocollo modificato dai metodi convenzionali per accogliere il paziente adulto ventilato standard. I campioni sono stati resi anonimi e inviati immediatamente per l'elaborazione.
- Se è indicata l'aspirazione tracheale, utilizzare un catetere per estrarre le secrezioni delle vie aeree.
- Far avanzare con cautela il catetere a metà nel tubo endotracheale e instillare 5 ml di soluzione fisiologica sterile allo 0,9% da una siringa preriempita da 10 ml.
- Quando il catetere è completamente avanzato o si incontra resistenza, aspirare le secrezioni e raccoglierle in un contenitore sterile per la raccolta dell'espettorato.
- Raccogliere 10 ml di secrezioni tracheali in un contenitore sterile per l'espettorato e metterlo sul ghiaccio. Inviare immediatamente i campioni per l'elaborazione.
3. Preparazione del campione di secrezione tracheale
NOTA: Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti sotto una cabina di biosicurezza con i dispositivi di protezione individuale adeguati.
- Disperdere 1 mL di campioni di secrezione delle vie aeree in 9 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) utilizzando una siringa di plastica da 10 mL (per una diluizione 10x). Utilizzare una pipetta smussata per omogeneizzare il campione di muco.
- Filtrare il diluente con un colino cellulare in nylon da 40 μm per rimuovere grossi pezzi o coaguli di sangue, che possono ostruire il foro di accesso alla microfluidica o il canale. Posizionare il campione sul ghiaccio dopo l'elaborazione.
- Disperdere il diluente di ciascun campione utilizzando un volume 100x di tampone PBS, ottenendo una sospensione diluita 1.000x. Posizionare il campione sul ghiaccio durante l'intera operazione di dissociazione.
4. Configurazione sperimentale
NOTA: Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti sotto una cabina di biosicurezza con i dispositivi di protezione individuale adeguati.
- Assemblare il chip PDMS con la guida del fluido per applicare un flusso uniforme a ciascuno dei quattro microcanali a spirale (Figura 1B).
nota: Sono stati utilizzati quattro canali per aumentare la produttività mediante parallelizzazione, nonché per ottimizzare il volume e la densità delle celle della sospensione risultante. La guida del fluido è progettata e realizzata con una stampante 3D di tipo stereolitografico con resina trasparente. La porta di ingresso e di uscita della guida del fluido utilizzano connettori Luer femmina per facilitare il collegamento e una tenuta stabile durante il funzionamento.
- Collegare un connettore Luer maschio da 1/16 di pollice all'ingresso, all'uscita della parete interna (IW) e alla porta di uscita della parete esterna (OW) della guida del fluido e collegare un tubo in silicone alla sospensione del campione.
- Inserire le punte smussate a ciascuna estremità dell'ingresso e delle uscite per raggiungere il fondo del serbatoio del campione.
- Collegare la pompa peristaltica con il tubo di ingresso.
- Posizionare l'estremità del tubo di ingresso e del tubo di uscita IW nel serbatoio del campione e posizionare l'estremità del tubo di uscita OW nel serbatoio di scarico (Figura 1C, D).
- Posizionare la provetta da 50 ml di PBS filtrato senza calcio e magnesio nel serbatoio del campione.
- Iniziare a pompare a una bassa portata (~1 mL/min) per adescare il dispositivo.
nota: Quando le bolle vengono catturate nel canale, spingere la parte superiore del canale con la pinzetta per destabilizzare ed eliminare le bolle d'aria. Quando il dispositivo è completamente riempito con una soluzione tampone, sostituire la provetta PBS per preparare la provetta del campione di secrezione delle vie aeree.
- Quando il campione viene inserito nel serbatoio del campione, accendere la pompa peristaltica e impostare la portata a 4 mL/min (Figura 1C, D).
- Quando il volume del campione raggiunge il volume designato (~1 mL), interrompere l'operazione e scollegare il tubo in silicone.
nota: Il metodo proposto è più efficiente nel ridurre un grande volume di diluente (>50 mL) in un volume di provetta per microcentrifuga (~1 mL) (Figura 2).
