Marcatura dei linfociti T helper murini utilizzando anticorpi monoclonali radiomarcati

Abstract

Fonte: Hoffmann, S. H. L., et al., Marcatura dei linfociti murini da parte del recettore ⁶⁴Cu-Antibody Targeting per il traffico cellulare in vivo da parte di PET/CT. J. Vis. Exp. (2017)

In questo video, dimostriamo la radiomarcatura intracellulare delle cellule T helper utilizzando anticorpi monoclonali coniugati con isotopi radioattivi per l'imaging non invasivo della tomografia a emissione di positroni.

Protocollo

1. Radiomarcatura cellulare cOVA-TH1

NOTA: I ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb saranno applicati alle cellule cOVA-TH1 in coltura per consentire la marcatura radioattiva intracellulare.

1. Per la marcatura cellulare cOVA-TH1, prelevare 37 MBq di ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcati in una siringa senza volume morto utilizzando un calibratore di dose. Aggiungere 1 mL di soluzione fisiologica per ricevere una soluzione da 37 MBq/mL.
2. Sospendere le cellule cOVA-TH1 nel terreno a 2 x 10⁶ cellule/mL e aggiungere 0,5 mL di sospensione cellulare a ciascun pozzetto in una piastra a 48 pozzetti.
3. Aggiungere 20 μL della soluzione ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb da 37 MBq/mL appena preparata a ciascun pozzetto della piastra a 48 pozzetti. Il rapporto finale per la marcatura è di 0,7 MBq per 10⁶ cellule in un volume di 520 μL. Incubare a 37 °C e 7,5% di CO₂ per 30 minuti.
4. Dopo l'incubazione, risospendere con cura le cellule in ciascun pozzetto e trasferire la sospensione cellulare dalla piastra da 48 pozzetti in una provetta con tappo a vite da 50 mL. Per ridurre al minimo la perdita di cellule, sciacquare ogni pozzetto con un mezzo preriscaldato.
5. Centrifugare la sospensione cellulare di cOVA-TH1 a 400 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 10 mL di PBS preriscaldato. Rimuovere un'aliquota della sospensione cellulare per il conteggio delle cellule. Ripetere la fase di lavaggio.
6. Contare le cellule cOVA-TH1 vitali in una diluizione appropriata con colorazione con blu di tripano.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Modulo di work-up 64Cu	WKL	Su misura	64Cu produzione
Calibratore di dose	Capintec	CRC-25R
ciclotrone in PETtrace	Sistemi medicali General Electric
DOTA-NHS	Macrociclica	B-280
Anticorpo anti-cOVA-TCR (KJ1-26)		Isolato da coltura cellulare di ibridoma	Coniugazione DOTA
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	Codice: 71633	Coniugazione DOTA
H+ Chelex 100	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C7901	Coniugazione DOTA
Unità filtrante Amicon Ultra-15	Merck Millipore	UFC910008	Coniugazione DOTA
Acqua ultrapura di Rotipuran	Carl Roth	HN68.3	Coniugazione DOTA
Acetato di ammonio	Sigma-Aldrich	Telefono 32301	Coniugazione DOTA
Pbs	Università di Tubinga		Coniugazione DOTA
Colonna Micro Bio-spin P-6	Laboratori Bio-Rad	7326221	Coniugazione DOTA
Citrato di sodio	Sigma-Aldrich	Codice: 71497	Coniugazione DOTA
Ciclone più PhosphorImager	Perkin-Elmer	L2250116	Coniugazione DOTA
DMEM	Merck Millipore	102568	Ingrediente per il terreno delle cellule T
Fcs	Merck Millipore	S0115/1004B	Ingrediente per il terreno delle cellule T
Piruvato di sodio	Merck Millipore	L0473	Ingrediente per il terreno delle cellule T
Aminoacidi MEM	Merck Millipore	K0293	Ingrediente per il terreno delle cellule T
HEPES	Merck Millipore	L 1613	Ingrediente per il terreno delle cellule T
Penicillina/Streptomicina	Merck Millipore	Codice: A2212	Ingrediente per il terreno delle cellule T
0,05 mM 2-β-mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	Codice: M3148	Ingrediente per il terreno delle cellule T
Mouse DO11.10		Allevamento interno	Coltura cellulare TH1
DPBS	Gibco	14190144	Coltura cellulare TH1
Filtro cellulare 40 μm	Corning	Codice 352340	Coltura cellulare TH1
ACK Tampone di lisi	Lonza	10-548E	Coltura cellulare TH1
CD4 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotech	Codice 130-097-145	Coltura cellulare TH1
Separatore QuadroMACS	Miltenyi Biotech	Codice 130-090-976	Coltura cellulare TH1
Colonna LS	Miltenyi Biotech	Codice 130-042-401	Coltura cellulare TH1
Anticorpo anti-CD4 (Gk1.5)		Isolato da coltura cellulare di ibridoma	Coltura cellulare TH1
Anticorpo anti-CD8 (5367.2)		Isolato da coltura cellulare di ibridoma	Coltura cellulare TH1
Anticorpo anti-ratto (MAR18.5)		Isolato da coltura cellulare di ibridoma	Coltura cellulare TH1
Complemento di coniglio MA	tebu-Bio	CL3221	Coltura cellulare TH1
Anticorpo anti-IL-4 (11B11)		Isolato da coltura cellulare di ibridoma	Coltura cellulare TH1
peptide cOVA 323-339	Micro-collezioni EMC	Ordine personalizzato	Coltura cellulare TH1
CPG1668-oligonucleotidi	Eurofins MWG Operon	Ordine personalizzato	Coltura cellulare TH1
IL-2	Novartis	Codice 65483-116-07	Coltura cellulare TH1
piastre a 96 pozzetti	Greiner	Codice 655180	Coltura cellulare TH1
Piastre a 24 pozzetti	Greiner	Codice 662160	Coltura cellulare TH1
Pallone per coltura cellulare	Greiner	660175	Coltura cellulare TH1
Piastre a 48 pozzetti	Greiner	677 180	Etichettatura delle celle
Gammacell 1000	Miglior Theratronics	Tramite richiesta
Gulmay RT225	Gulmay	Tramite richiesta
Tripan blu	Merck Millipore	L6323	Valutazione in vitro