Una tecnica in vitro per differenziare le cellule T helper produttrici di GM-CSF dalle cellule T naive

Abstract

Fonte: Lu, Y., et al. Differenziazione in vitro di cellule T helper (GM-CSF) produttrici di granulociti-macrofagi-fattori stimolanti le colonie di topo (GM-CSF).J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra la differenziazione in vitro del fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi o delle cellule T helper produttrici di GM-CSF (T_HGM). Le cellule T naïve isolate sono stimolate per la differenziazione in T_HGM, che è confermata dal rilevamento di un'elevata produzione intracellulare di GM-CSF e di una bassa espressione di altre citochine specifiche delle cellule T helper.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Reagente e preparazione del materiale

1. Preparare 500 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS) e 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
   nota: Mantenere il tampone in ghiaccio durante l'intera procedura per ottenere risultati ottimali.
2. Preparare 50 ml di terreno RPMI completo contenente RPMI 1640, 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina. Per la differenziazione delle cellule T_HGM, utilizzare terreni RPMI completi contenenti 50 μM di β-mercaptoetanolo. Aggiungere il β-mercaptoetanolo in una cappa aspirante.
3. Preparare 7,5 mL di una miscela di anticorpi anti-CD3e diluendo il brodo concentrato anti-CD3e a 3 μg/mL in PBS. Rivestire le piastre da 48 pozzetti aggiungendo 150 μl della miscela di anticorpi a ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 °C per almeno 1 ora o a 4 °C durante la notte.
4. Sterilizzare un paio di forbici e pinze e tenerle in etanolo al 70% tra una dissezione e l'altra.

2. Preparazione degli splenociti murini

1. Eutanasia del topo (6-8 settimane di età) utilizzando un'asfissia da CO₂ approvata istituzionalmente o una lussazione cervicale. Spruzzare il mouse con etanolo al 70% e montarlo su un blocco di polistirolo sul retro. Trasferisci il topo in una cabina di sicurezza biologica per procedere con i seguenti passaggi.
2. Tenere la pelle con un paio di pinze e tagliare la pelle sotto la gabbia toracica sul lato sinistro per circa 4 cm, usando un paio di forbici. Aprire il sacco peritoneale per esporre la milza e utilizzare una pinza sterile per estrarre la milza.
3. Posizionare un filtro cellulare da 70 μm su una provetta da 50 mL e pre-bagnarlo con 2 mL di tampone. Posizionare le milze sul colino cellulare (2-3 milze per un colino cellulare) e macerarle utilizzando l'estremità di uno stantuffo a siringa da 5 ml.
4. Sciacquare più volte il filtro e la provetta con 1-2 mL di tampone di isolamento cellulare fino a quando tutte le cellule non sono state lavate nella provetta. Scartare il filtro cellulare e centrifugare le cellule a 350 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
5. Risospendere il pellet cellulare con 5 mL di tampone lisano freddo (4 °C) ammonio-cloruro-potassio (ACK) (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM Na₂EDTA; pH 7,2-7,4) e mescolarli delicatamente per 2 min. Aggiungere 10 mL di terreno RPMI completo per neutralizzare il tampone ACK e centrifugare immediatamente le cellule a 350 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante dopo la centrifugazione.

3. Isolamento delle cellule T CD4⁺ utilizzando microsfere magnetiche CD4 e una colonna di separazione cellulare

1. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone di isolamento cellulare. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro di pre-separazione (30 μm) in una nuova provetta da 15 ml per rimuovere eventuali detriti.
2. Prelevare 10 μl della sospensione cellulare ed effettuare una diluizione 10x aggiungendo 90 μl di tampone. Prelevare 10 μl della sospensione cellulare diluita e mescolarla con 10 μl di blu di tripano per il conteggio delle cellule. Contare le cellule in un emocitometro per determinare la resa delle cellule vitali.
3. Centrifugare le cellule a 350 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
4. Risospendere le cellule in 90 μL di tampone per^10-7 cellule. Aggiungere 10 μl di microsfere magnetiche CD4 per 10⁷ cellule. Incubare le cellule per 15 minuti a 4 °C. Per ottenere risultati ottimali, mescolare delicatamente la sospensione cellulare ogni 5 minuti durante l'incubazione.
5. Durante l'incubazione delle cellule, posizionare una colonna di separazione sul supporto magnetico. Pre-bagnare la colonna con 2 mL di tampone.
6. Al termine dell'incubazione della cellula/perlina, lavare le cellule con 5 mL di tampone e centrifugarle a 350 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
7. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone, caricare il campione nella colonna di separazione cellulare e lasciarlo fluire. Utilizzare una provetta da centrifuga da 15 ml per raccogliere la frazione di cellule CD4. Aggiungere 1 ml di tampone per lavare il serbatoio prima che sia asciutto. Ripetere la fase di lavaggio 2 volte.
8. Rimuovere la colonna di separazione cellulare dal supporto magnetico e posizionarla su una nuova provetta da centrifuga da 15 mL. Aggiungere 2 mL di tampone di isolamento cellulare alla colonna di separazione cellulare e applicare saldamente lo stantuffo per forzare le cellule fuori dalla colonna.
9. Centrifugare la frazione a 350 x g per 5 minuti a 4 °C per ottenere cellule CD4⁺. Scartare il surnatante.

4. Purificazione delle cellule T CD4⁺ naive (CD4⁺CD25-CD44^loCD62L^hi) mediante Cell Sorting attivato dalla fluorescenza e differenziazione T_HGM

1. Risospendere il pellet di cella CD4⁺ ottenuto in 500 μL di tampone. Mescolare le cellule con una miscela di anticorpi coniugati fluorescenti contenente CD4-PerCp (2,8 μg/mL), CD44-APC (2,4 μg/mL), ^CD25-PE (2 μg/mL) e CD62L-FITC (10 μg/mL) (Tabella 1). Incubare le cellule su ghiaccio per 20-30 minuti, proteggendole dalla luce.
   nota: Le concentrazioni degli anticorpi sono state ottimizzate in precedenza in laboratorio. Il numero di anticorpi elencati è per le cellule di 1-2 topi.
2. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con 5 mL di tampone e centrifugare le cellule a 350 x g per 5 minuti a 4 °C.
3. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 500 μL di tampone. Filtrare nuovamente le celle utilizzando una rete di nylon.
4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta FACS per lo smistamento delle cellule. Prerivestire le provette FACS di raccolta con 500 μL di tampone.
5. Ottenere una popolazione^CD4+CD25-CD44^loCD62L hi (di cellule T CD4⁺ naive) mediante smistamento FACS. Gate su CD4⁺CD25^- prima, e poi selezionare^{CD44 lo}CD62L^hi cellule da questa popolazione.
6. Raccogli le frazioni naive delle cellule T CD4⁺ in una nuova provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare le cellule a 350 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
7. Risospendere le cellule T CD4⁺ naive a una concentrazione di 106 cellule/mL in un terreno RPMI completo contenente 50 μM di β-mercaptoetanolo.
8. Aspirare gli anticorpi anti-CD3e utilizzati per il prerivestimento nella piastra a 48 pozzetti. Seminare 0,25 milioni (250 μL) di cellule in ciascun pozzetto con IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 μg/mL) e anti-IFNγ (10 μg/mL) (Tabella 1).
   nota: Le concentrazioni di citochine e anticorpi sono state precedentemente ottimizzate in laboratorio per una differenziazionedelle cellule GH GM.
9. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% per 3 giorni. Non cambiare il terreno durante l'incubazione.

5. Analisi delle cellule GM di topo T_Hgenerate in vitro

1. Utilizzando un microscopio, controllare la differenziazione cellulare 3 giorni dopo la differenziazione. Raccogliere le cellule e centrifugarle a 350 x g per 5 minuti a 4 °C. Lavare le cellule 2 volte con un media RPMI completo.
   nota: Le cellule differenziate sono di dimensioni maggiori rispetto alle cellule T CD4⁺ naive.
2. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno RPMI completo. Prelevare 10 μL di sospensione cellulare e mescolarla bene con 10 μL di blu di tripano per determinare il numero di cellule con un emocitometro. Dividi le cellule differenziate in tre pozioni per la restimolazione e l'analisi.
   nota: La colorazione intracellulare delle citochine richiede ≥0,5 milioni di cellule.
3. Per la colorazione intracellulare delle citochine, ristimolare le cellule con forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) (100 ng/mL) e ionomicina (1 μg/mL) in presenza di un inibitore del trasporto proteico (1 μL/mL) per 4-6 ore.
   1. Raccogliere le cellule e colorarle con anticorpi anti-CD4 (coniugati con PerCP, 0,2 mg/mL, diluizione 1:100; o coniugati con FITC, 0,5 mg/mL, diluizione 1:100) per 30 minuti.
   2. Fissare le cellule con 200 μL di tampone di fissazione per 20-60 minuti. Dopo la fissazione, lavare le cellule 2 volte con 1 mL di tampone di permeabilizzazione.
   3. Eseguire la colorazione intracellulare con anticorpi contro GM-CSF (PE-coniugato, 0,2 mg/mL, diluizione 1:100), IL-17A (coniugato FITC, 0,5 mg/mL, diluizione 1:100; coniugato con APC, 0,2 mg/mL, diluizione 1:100), IL-4 (coniugato con APC, 0,2 mg/mL, diluizione 1:100) e IFNγ (coniugato con APC, 0,2 mg/mL, diluizione 1:100; PE-coniugato, 0,2 mg/mL, diluizione 1:100) per 30 minuti al buio.

Tabella 1: Citochine e anticorpi usati.

nome	Concentrazione delle scorte	Concentrazione lavorativa	diluizione	Volume in tampone di colorazione da 500 μl
CD4-PerCp	0,2 mg/mL	2,8 μg/mL	1:71	7 μl
CD44-APC	0,2 mg/mL	2,4 μg/mL	Ore 1:83	6 μl
CD25-PE	0,2 mg/mL	2 μg/mL	s1:100	5 μl
CD62L-FITC	0,5 mg/mL	10 μg/mL	1:50	10 μl
GM-CSF-PE	0,2 mg/mL	2 μg/mL	s1:100
IL-17A-FITC	0,5 mg/mL	5 μg/mL	s1:100
IL-17A-APC	0,2 mg/mL	2 μg/mL	s1:100
IFNγ-APC	0,2 mg/mL	2 μg/mL	s1:100
Fibra IFNγ-PE	0,2 mg/mL	2 μg/mL	s1:100
IL-4-APC	0,2 mg/mL	2 μg/mL	s1:100
CD4-FITC	0,5 mg/mL	5 μg/mL	s1:100
IL-7	20 μg/mL	2 ng/mL	s1:10000
Anti-CD28	0,5 mg/mL	1 μg/mL	s1:500
Anti-IFNγ	1 mg/mL	10 μg/mL	s1:100

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
RPMI 1640	Bioovest	L0500-500
FBS inattivato a caldo	Capricorno	FBS-HI-12A
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122
10x PBS	1° Base	BUF-2040-10	Diluito a 1x PBS in acqua sterile
Edta	1° Base	BUF-1053-100ml-pH8.0
Buffer ACK 10X	Bioleggenda	420301	diluito in acqua sterile
Filtro cellulare	SPL Scienze della Vita	Codice 93070
Microsfere CD4	Miltenyi Biotec	Codice 130-049-201
2-mercaptoetanolo	sigma	Visualizzazione del materiale M7522
Colonna LS	Miltenyi Biotec	Codice 130-042-401
Supporto magnetico	Miltenyi Biotec	Codice 130-042-303
Siringa da 1 ml	Terumo	SS+01T
centrifuga	Eppendorf	Eppendorf 5810R
Selezionatore di celle Sony SY3200	Sony	Selezionatore di celle Sony SY3200
Provetta da centrifuga conica da 50 ml	Greiner Bio-One	210261
Tubo da centrifuga conico da 15 m	Greiner Bio-One	188271
Tubo FACS	Corning	352054
antitopo CD4 PerCP-eFluor 710	eBioscience	46-0041-82
CD25 anti-topo coniugato PE (IL-2Ra, p55)	eBioscience	12-0251-82
anti-umano/topo CD44 APC	eBioscience	Codice 17-0441-82
antitopo CD62L FITC	eBioscience	11-0621-85
Camera di conteggio migliorata Neubauer	Marienfeld	Codice 640010
Hyclone Trypan Soluzione Blu	GE healthcare Scienze della vita	SV30084.01
microscopio	Nikon	Nikon Elipse TS100
Anticorpo CD3e anti-topo purificato	Bioleggenda	100314
Criceto purificato anti-topo CD28	BD Bioscienze	553295
Ratto purificato anti-topo IFNγ	eBioscience	Codice 16-7312-85
Anticorpo IL-4 purificato anti-topo	Bioleggenda	504102
Proteina IL-7 ricombinante di topo	Sistema di ricerca e sviluppo	407-ML
Pma	Merck Millipore	19-144
Ionomicina	sigma	I0634
Inibitore del trasporto della proteina GolgiPlug	BD Bioscienze	51-2301KZ
Set di tamponi per fissazione intracellulare e permeabilizzazione	eBioscience	88-8824-00
antitopo GM-CSF PE	eBioscience	12-7331-82
FITC anti-topo IL-17A	Bioleggenda	506908
APC anti-topo IFN-gamma	Bioleggenda	Codice: 505810