Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Dissociazione cerebrale e isolamento magnetico microgliale
NOTA: Tutte le manipolazioni cellulari e le risospensioni devono essere eseguite con una pipetta da 1.000 μL con grande cautela. L'applicazione di un'elevata azione meccanica può attivare o uccidere le cellule della microglia.
- Trasferire 12 pezzi di cervello (~1,2 g) per provetta di dissociazione contenente la miscela di dissociazione secondo la Tabella 1. Per 24 cuccioli, saranno necessari quattro tubi a C (Figura 1A-B).
- Posizionare i tubi C sul dissociatore (con la modalità di riscaldamento). Avviare il programma NTDK ottimizzato nell'apparecchiatura secondo le istruzioni del produttore (Figura 1D).
- Centrifugare a 300 x g per 20 s (a 4 °C) per raccogliere tutte le cellule. Completare la dissociazione meccanica pipettando tre volte su e giù con una pipetta da 1.000 μl (Figura 1E).
- Trasferire le cellule in quattro provette da 15 mL + filtri. Sciacquare i filtri con 10 ml di 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) con Ca2+ e Mg2+ (HBSS+/+) (Figura 1F).
- Centrifugare a 300 x g per 10 min (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere con cautela il pellet con 10 mL di HBSS+/+ (Figura 1G).
- Centrifugare a 300 x g per 10 min (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere con cautela il pellet con 6 mL di tampone di selezione (1x PBS + 0,5% BSA) (Figura 1H).
- Centrifugare a 300 x g per 10 min (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 μl di soluzione di microsfere CD11b per provetta e risospendere con cautela (Figura 1I).
- Incubare le provette per 15-20 minuti a 4 °C. Risospendere con cautela il pellet con 6 mL di tampone di selezione (Figura 1I-J).
- Centrifugare a 300 x g per 10 min (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere con cautela il pellet con 8 mL di tampone di selezione (Figura 1K).
- Seguire il programma POSSEL sul separatore (vedi Tabella dei materiali) per preparare otto colonne. Trasferire le celle da 1 mL per 1 mL sulla colonna. Attendere che tutte le cellule passino prima di aggiungere un altro ml. Eluire le cellule CD11b+ su una piastra di eluizione sterile con 1 mL di tampone di selezione (Figura 1L).
- Raggruppare le cellule CD11b+ in una nuova provetta da 50 mL (Figura 1M).
- Centrifugare a 300 x g per 10 min (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere con cautela il pellet con 10 mL di terreno per microglia freddo (terreno di coltura privo di siero di macrofagi (SFM) + 1% di penicillina-streptomicina (P/S)) (Figura 1N).
- Conta le cellule CD11b+. A P8, si dovrebbero ottenere ~650.000 cellule per cervello.
nota: Nel presente protocollo, le celle sono state contate utilizzando un contatore automatico di celle (vedi Tabella dei materiali).
- Risospendere le cellule in terreno di microglia freddo fino a una concentrazione finale di 650.000-700.000 cellule/mL e dispensare in piastre di coltura cellulare.
nota: Le piastre a 6 pozzetti sono per Western Blot (2 mL per pozzetto); le piastre a 12 pozzetti sono per l'analisi RT-qPCR (1 mL per pozzetto) e le piastre a 96 pozzetti sono per il test fagocitario (250 μL per pozzetto).
Tabella 1: Preparazione della miscela di dissociazione.
| soluzione | Per una provetta C (μL) | Per quattro provette C (μL) |
| Buffer X | 2850 | Codice: 11400 |
| Enzima P (Papaina) | 75 | 300 |
| Enzima A (DNAsi) | 15 | 60 |
| Buffer Y | 30 | 120 |
| totale | Ore 2970 | Codice: 11880 |
