Isolamento magnetico della microglia dal cervello di un cucciolo di topo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Dissociazione cerebrale e isolamento magnetico microgliale

NOTA: Tutte le manipolazioni cellulari e le risospensioni devono essere eseguite con una pipetta da 1.000 μL con grande cautela. L'applicazione di un'elevata azione meccanica può attivare o uccidere le cellule della microglia.

1. Trasferire 12 pezzi di cervello (~1,2 g) per provetta di dissociazione contenente la miscela di dissociazione secondo la Tabella 1. Per 24 cuccioli, saranno necessari quattro tubi a C (Figura 1A-B).
2. Posizionare i tubi C sul dissociatore (con la modalità di riscaldamento). Avviare il programma NTDK ottimizzato nell'apparecchiatura secondo le istruzioni del produttore (Figura 1D).
3. Centrifugare a 300 x g per 20 s (a 4 °C) per raccogliere tutte le cellule. Completare la dissociazione meccanica pipettando tre volte su e giù con una pipetta da 1.000 μl (Figura 1E).
4. Trasferire le cellule in quattro provette da 15 mL + filtri. Sciacquare i filtri con 10 ml di 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) con Ca²⁺ e Mg²⁺ (HBSS+/+) (Figura 1F).
5. Centrifugare a 300 x g per 10 min (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere con cautela il pellet con 10 mL di HBSS+/+ (Figura 1G).
6. Centrifugare a 300 x g per 10 min (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere con cautela il pellet con 6 mL di tampone di selezione (1x PBS + 0,5% BSA) (Figura 1H).
7. Centrifugare a 300 x g per 10 min (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 μl di soluzione di microsfere CD11b per provetta e risospendere con cautela (Figura 1I).
8. Incubare le provette per 15-20 minuti a 4 °C. Risospendere con cautela il pellet con 6 mL di tampone di selezione (Figura 1I-J).
9. Centrifugare a 300 x g per 10 min (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere con cautela il pellet con 8 mL di tampone di selezione (Figura 1K).
10. Seguire il programma POSSEL sul separatore (vedi Tabella dei materiali) per preparare otto colonne. Trasferire le celle da 1 mL per 1 mL sulla colonna. Attendere che tutte le cellule passino prima di aggiungere un altro ml. Eluire le cellule CD11b+ su una piastra di eluizione sterile con 1 mL di tampone di selezione (Figura 1L).
11. Raggruppare le cellule CD11b+ in una nuova provetta da 50 mL (Figura 1M).
12. Centrifugare a 300 x g per 10 min (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere con cautela il pellet con 10 mL di terreno per microglia freddo (terreno di coltura privo di siero di macrofagi (SFM) + 1% di penicillina-streptomicina (P/S)) (Figura 1N).
13. Conta le cellule CD11b+. A P8, si dovrebbero ottenere ~650.000 cellule per cervello.
    nota: Nel presente protocollo, le celle sono state contate utilizzando un contatore automatico di celle (vedi Tabella dei materiali).
14. Risospendere le cellule in terreno di microglia freddo fino a una concentrazione finale di 650.000-700.000 cellule/mL e dispensare in piastre di coltura cellulare.
    nota: Le piastre a 6 pozzetti sono per Western Blot (2 mL per pozzetto); le piastre a 12 pozzetti sono per l'analisi RT-qPCR (1 mL per pozzetto) e le piastre a 96 pozzetti sono per il test fagocitario (250 μL per pozzetto).

Tabella 1: Preparazione della miscela di dissociazione.

Figura 1: Rappresentazione schematica delle dissociazioni cerebrali e dell'isolamento delle cellule microgliali. (A-C) Dopo la dissezione cerebrale del topo P8 e la rimozione dei bulbi olfattivi e del cervelletto, i cervelli sono stati prima trasferiti in una capsula di Petri con HBSS+/+ e poi in tubi di dissociazione contenenti la miscela di dissociazione. I tubi C sono stati posizionati sul dissociatore (con la modalità di riscaldamento) ed è stato avviato il programma NTDK (D). (E) Al termine del programma, le provette sono state centrifugate a 300 x g per 20 s a 4 °C; La dissociazione è stata quindi completata pipettando tre volte su e giù con una pipetta da 1.000 μl. (F) Le cellule sono state quindi trasferite in provette da 15 mL + filtri da 70 μm e risciacquate con 10 mL di HBSS+/+. (G) I campioni sono stati quindi centrifugati a 300 x g per 10 minuti a 4 °C, il surnatante è stato rimosso e il pellet è stato risospeso con 10 mL di HBSS+/+. (H) Le provette sono state nuovamente centrifugate a 300 x g per 10 minuti a 4 °C; il surnatante è stato rimosso e quindi il pellet è stato risospeso in 6 mL di tampone di selezione. (I) Le provette sono state centrifugate a 300 x g per 10 minuti a 4 °C, il surnatante è stato rimosso ed è stata aggiunta la soluzione di microsfere CD11b (200 μL). Le provette sono state incubate per 15-20 minuti a 4 °C, quindi risospese in 6 mL di tampone di selezione (J) e centrifugate a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. (K) Il surnatante è stato rimosso e il pellet è stato accuratamente risospeso in 8 mL di tampone di selezione. (L) Quindi, avviare il programma POSSEL sul separatore per preparare le colonne. Le cellule sono state trasferite 1 mL per 1 mL sulla colonna e le cellule CD11b sono state eluite su una piastra di eluizione sterile con 1 mL di tampone di smistamento. Le cellule CD11b (M) sono state raggruppate in una nuova provetta da 50 mL e centrifugate a 300 x g per 10 minuti a 4 °C, mentre il surnatante è stato rimosso. (N) Nell'ultimo passaggio, il pellet è stato accuratamente risospeso in 10 mL di terreno di microglia freddo. Le cellule sono state contate e diluite nel terreno microgliale fino a una concentrazione finale di 650.000-700.000 cellule/mL dispensate in piastre di coltura cellulare.