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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di Topi e DSS
- Tenere i topi knockout (α-gustducin-/-) e i topi C57BL/6 con controllo wild-type abbinato per età, sesso e peso corporeo (α-gustducin+/+) individualmente in gabbie pulite.
nota: I topi knockout sono stati reincrociati con topi C57BL/6 per oltre 20 generazioni e hanno un background genetico quasi al 100% di C57BL/6.
- Sciogliere 30 g di destrano solfato di sodio (DSS) in polvere in 1 L di acqua autoclavata. Mescolare fino a quando la soluzione diventa limpida per garantire che la concentrazione finale di lavoro sia del 3% (p/v).
nota: La soluzione DSS può essere conservata a temperatura ambiente per un massimo di 1 settimana o a 4 °C fino all'uso.
2. Induzione e valutazione della colite DSS nei topi
- Pesa e registra il peso corporeo iniziale di ogni topo. Metti i topi singolarmente in gabbie di plastica standard ed etichetta le gabbie.
- Sostituire l'acqua potabile normale con una soluzione di DSS al 3% per un totale di 7 giorni a cui entrambi i gruppi di topi hanno accesso ad libitum.
- Misurare il peso corporeo del topo, registrare il consumo di soluzione DSS e raccogliere ed esaminare le feci di ciascun topo ogni giorno durante la somministrazione del DSS. Osservare la gravità della diarrea e del sanguinamento rettale e convertirla nell'indice di malattia indotta dal DSS.
- Durante l'esperimento, la percentuale di perdita di peso rispetto al peso iniziale e l'indice di malattia vengono calcolati per valutare i sintomi della colite.
nota: L'indice di malattia viene valutato combinando le osservazioni di diarrea e sanguinamento rettale ed è definito come segue: 0 (feci normali, senza sangue), 1 (feci molli, senza sangue), 2 (feci molli, poco sangue), 3 (feci molto molli, sanguinamento modesto) e 4 (feci acquose, sanguinamento significativo). L'indice di malattia viene analizzato quotidianamente per ogni topo.
- Entro la fine del trattamento DSS di 7 giorni, sacrificare i topi mediante lussazione cervicale e procedere con gli esperimenti rimanenti.
3. Preparazione dei campioni di tessuto
- Metti il mouse in posizione supina e pulisci la pelle dell'addome con etanolo al 70%. Praticare un'incisione della linea mediana lunga 3 cm nell'addome con un paio di piccole forbici per esporre la cavità addominale.
- Usa un paio di pinze per separare con cura la milza dagli altri tessuti, quindi rimuovi la milza e misurane le dimensioni.
- Identificare e sollevare il colon con una pinza e separarlo dal mesentere circostante. Estrarre l'intero colon fino a quando il cieco e il retto sono visibili.
- Isolare il colon sezionandolo al margine coloncecale e in profondità nel bacino per liberare rispettivamente il colon prossimale e distale. Quindi, misurare e registrare la lunghezza del colon isolato. Fare attenzione a non danneggiare il tessuto del colon durante la procedura di dissezione.
- Sciacquare il colon con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) con una siringa da 10 ml dotata di ago per rimuovere le feci e il sangue fino a quando l'eluato non è completamente limpido.
- Per l'identificazione istologica, dividere i campioni di tessuto in parti uguali in tre parti: prossimale, media e distale. Quindi, fissare il tessuto con paraformaldeide (PFA) al 4% per una notte a 4 °C.