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1. Elettroporazione
- Porre 400 μl di sospensione cellulare in una cuvetta pre-raffreddata e aggiungere 20 μg di proteina selezionata alla cuvetta (50 μg/ml).
- Agitare delicatamente la cuvetta ~10 volte per mescolare senza danneggiare le cellule. nota: La cuvetta può anche essere capovolta più volte per miscelare accuratamente, ma non pipettare su e giù o vorticare per evitare di danneggiare le cellule.
- Asciugare l'esterno della cuvetta con un tovagliolo di carta o un altro tergicristallo per evitare la formazione di archi elettrici nell'elettroporatore.
- Campione elettroporato a 0,3 kV per 1,5-1,7 msec. Nota: questo era tipico per questo studio.
- Subito dopo l'elettroporazione, agitare delicatamente la cuvetta ~10 volte per mescolare accuratamente.
2. Placcatura delle celle
- Conservare la cuvetta con le celle elettroporate sul ghiaccio fino al momento di essere inserita nelle piastre di recupero.
- Per la maggior parte delle analisi a valle, lavare le celle 1 volta con NGM preriscaldato per rimuovere la proteina effettrice estranea.
- Rimuovere le cellule per l'analisi e sospenderle in 3-5 ml di NGM.
- Celle a pellet per centrifugazione a 900 x g per 4 min.
- Risospendere in un volume adeguato di NGM per la dimensione della piastra desiderata (ad esempio, 2 ml per una piastra da 35 mm).
- Rimuovere la quantità appropriata di celle per l'analisi a valle.
- Esempio 1: Piastra in piastre con fondo di vetro per l'analisi al microscopio.
- Esempio 2: Piastra in plastica per colture cellulari per l'analisi delle proteine, come le purificazioni per affinità.
- Lasciare che le cellule si riprendano in piastre equilibrate in un'atmosfera umidificata al 95% di aria/5% di CO2 a 37 °C per almeno 4 ore.
3. Analisi al microscopio
- Fissazione/Colorazione in immunofluorescenza
- Lavare le celle 1 volta con PBS sterile dopo un periodo di recupero di 4 ore.
- Fissare le celle in metanolo al 100% per 2 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare una quantità di metanolo sufficiente a coprire completamente le cellule (ad es. 2 ml per una piastra da 35 mm).
- Lavare 3 volte con PBS sterile.
- Permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,4% in PBS per 15 minuti. Ad esempio, utilizzare 1 ml per una piastra di 35 mm di diametro.
- Regolare la lunghezza della permeabilizzazione e la forza di Triton X-100 in base all'epitopo e alla posizione della proteina bersaglio. nota: I migliori risultati dovranno essere determinati empiricamente per ciascun bersaglio, tuttavia, le condizioni di cui sopra dovrebbero essere adeguate per la maggior parte dei bersagli citosolici.
- Blocco con albumina sierica bovina (BSA) al 5% in PBS per 1 ora a RT. Ad esempio, utilizzare 1 ml per una piastra di 35 mm di diametro.
- Lavare 3 volte con PBS.
- Incubare l'anticorpo primario in una soluzione legante gli anticorpi (0,1% Triton X-100 e 1% BSA in PBS) per una notte a 4 °C con un leggero oscillamento. Ad esempio, utilizzare 0,5 ml per una piastra di 35 mm di diametro.
- Seguire le raccomandazioni del produttore per la diluizione degli anticorpi. nota: Ad esempio, l'anticorpo del peptide legante la streptavidina (SBP-tag) è stato utilizzato a diluizione 1:1.000, mentre l'anticorpo PKN1 è stato utilizzato a diluizione 1:200.
- Lavare 4 volte con PBS.
- Incubare con un appropriato anticorpo secondario coniugato fluorescente in soluzione legante l'anticorpo per 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
- Ad esempio, usa Alexa 488 o Alexa 647 per 1 ora a temperatura ambiente.
- Seguire le raccomandazioni del produttore per la diluizione degli anticorpi. (ad esempio, circa 1:1.000 per questo studio).
- Aggiungere altri coloranti secondo necessità, ad esempio 5 μM di agglutinina di germe di grano (WGA) coniugata ad Alexa 647 o DAPI secondo le raccomandazioni del produttore, per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare 5 volte con PBS e conservare a 4 °C, al riparo dalla luce fino al momento dell'immagine.