Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Coltivazione di Malassezia in condizioni di laboratorio
NOTA: Conservare tutti i reagenti e i terreni utilizzati per questo protocollo a temperatura ambiente (RT, 20 – 25 °C) se non diversamente specificato, poiché la temperatura più bassa può inibire la crescita fungina.
- Preparare il terreno di coltura Dixon (mDixon) modificato in liquido per la crescita della Malassezia. Per preparare 500 ml di terreno liquido mDixon, sciogliere 18 g di estratto di malto, 10 g di bile di bue essiccata, 5 ml di Tween-40, 3 g di peptone, 1 ml di glicerolo e 1 ml di acido oleico in 500 ml di H2O distillato (dH2O). Regolare il terreno a pH 6 con HCl e autoclave. Conservare il supporto in RT.
- Preparare le piastre di agar mDixon aggiungendo 7,5 g di agar agar a 500 ml di terreno mDixon prima della sterilizzazione in autoclave. Raffreddare lentamente l'agar mDixon dopo la sterilizzazione in autoclave utilizzando una barra di sterzo e una piastra riscaldante magnetica per evitare la solidificazione parziale del fluido durante il raffreddamento.
- Una volta che l'agar si è raffreddato a 50 – 60 °C, erogare il liquido in piastre di Petri in una cappa a flusso laminare e lasciarle asciugare a RT per una notte.
nota: Le piastre di agar possono essere conservate a 4 °C per diverse settimane se avvolte e mantenute capovolte per evitare l'evaporazione.
- Ottenere Malassezia isolati e ravvivare ceppi liofilizzati di Malassezia secondo le istruzioni ottenute dal fornitore.
- Inoculare 10 mL di terreno liquido mDixon in un pallone sterile di Erlenmeyer da 100 mL con la sospensione di Malassezia ravvivata secondo le istruzioni ottenute dal fornitore. Incubare la coltura in un'incubatrice vibrante a 30 °C e 180 giri/min.
- Ispezionare regolarmente la crescita della coltura di Malassezia controllando l'aspetto del colore crema e della torbidità. La cinetica di crescita dipende dalla specie e dal ceppo di Malassezia e può essere particolarmente lenta quando la Malassezia viene appena rianimata da un ceppo liofilizzato. (Figura 1A).
- Preparare le scorte di glicerolo mescolando 3 parti della coltura di Malassezia densamente cresciuta in terreno mDixon con 1 parte di glicerolo sterile al 99%. Aliquotare la miscela Malassezia/glicerolo in provette sterili con tappo a vite e conservare a -80 °C.
- Per la propagazione in vitro, prelevare la Malassezia dalla coltura liquida in mDixon o dal cpieno di glicerolo congelato su una piastra di agar mDixon (portata a RT da 4 °C) utilizzando un circuito di inoculazione.
nota: Trasferire le piastre di agar mDixon in RT a partire da 4 °C prima dell'uso, poiché l'agar mDixon freddo inibisce la crescita dei funghi.
- Incubare la piastra o le piastre di agar con Malassezia capovolte in un'incubatrice (non agitante) a 30 °C. Ispezionare regolarmente la crescita delle colonie di Malassezia.
NOTA: Le colonie di Malassezia sulle placche di agar mDixon compaiono entro 3-5 giorni e sono di colore crema, opache e lisce con elevazione convessa (Figura 1B).
- Conservare le colonie di Malassezia su piastre di agar mDixon a RT per ~ 2 settimane. Successivamente, preparare una nuova piastra di agar mDixon strisciando la Malassezia dal brodo di glicerolo congelato come descritto in 1.7.
2. Preparazione dell'inoculo per l'infezione sperimentale da Malassezia nei topi
- Inoculare 10 mL di terreno liquido mDixon in un pallone sterile di Erlenmeyer da 100 mL con 3-5 colonie individuali di Malassezia da una piastra di agar mDixon (vedere la fase 1, Figura 1B).
- Incubare la coltura di Malassezia per ~ 48-96 ore a 30 °C e 180 giri/min fino a quando la coltura non sarà color crema e torbida (Figura 1A).
nota: Il tempo necessario per la crescita della Malassezia dipende dalla specie e dal ceppo di Malassezia e dalla quantità di fungo utilizzato per l'inoculazione.
- Trasferire 2 mL di coltura di Malassezia in una provetta sterile da microcentrifuga da 2 mL e centrifugare per 1 minuto a 10.000 x g.
- Scartare il surnatante e lavare il pellet sospendendolo in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Centrifugare nuovamente per 1 minuto a 10.000 x g.
- Dopo il lavaggio, sospendere il pellet in 1 mL di PBS mediante pipettaggio energico e misurare la densità ottica della soluzione a 600 nm (ODA600) utilizzando uno spettrometro. Diluire la sospensione di Malassezia 20 – 50 x con PBS per la misurazione del diametro esterno per assicurarsi che la lettura sia compresa tra 0,1 e 1,
nota: La densità di una coltura di Malassezia di 3 giorni varia generalmente tra 15 e 30 ODA600, a seconda della specie e del ceppo di Malassezia e del numero di cellule di lievito utilizzate per l'inoculazione della coltura (fase 2.1). La Malassezia tende a formare aggregati, pertanto è necessario un vigoroso pipettaggio per garantire l'omogeneità della sospensione.
- Aliquotare un volume della sospensione di Malassezia in PBS che corrisponde a una densità di 4 ODA600 in una provetta sterile da 2 mL. Preparare 1 provetta per ogni animale da infettare.
- Centrifugare le provette contenenti Malassezia per 1 minuto a 10.000 x g.
- Scartare il surnatante e sospendere il pellet di Malassezia in 200 μL di olio d'oliva nativo (corrispondente a 2 cellule di lievito ODA600/100 μl di olio d'oliva).
nota: L'olio d'oliva è risultato essere un buon veicolo per l'infezione epicutanea da Malassezia, poiché la Malassezia è un lievito lipofilo e lipidico-dipendente. L'olio d'oliva viene assorbito meglio dalla pelle rispetto al PBS. Tuttavia, tieni presente che non è facile sospendere la Malassezia nell'olio d'oliva. Migliora la sospensione di Malassezia/olio d'oliva mediante vortex. Mantenere la sospensione a RT fino a quando non viene utilizzata per l'infezione.
- Preparare tubi con solo olio d'oliva per simulare l'infezione degli animali di controllo.
3. Infettare i topi con Malassezia
- Ordina topi femmina C57BL/6 all'età di 6-8 settimane e lasciali acclimatare nella struttura per animali da esperimento per almeno una settimana. Calcola per 3-5 topi per gruppo, incluso un gruppo di controllo non infetto.
- Preparare un cocktail anestetico sterile contenente 1,3 mg/mL di xilazina e 6,5 mg/mL di ketamina in PBS. 5 mL di cocktail anestetico sono sufficienti per anestetizzare 20 animali. Regolare il volume del cocktail in base al numero di animali da anestetizzare.
- Anestetizzare gli animali iniettando 10 μL/g di peso corporeo di cocktail anestetico per via intraperitoneale (corrispondenti a 65 mg di ketamina e 13 mg di xilazina per kg di peso corporeo) e posizionare gli animali anestetizzati su un termoforo a 37 °C.
nota: Alla dose indicata, gli animali di solito rimangono anestetizzati per ~ 30 - 60 minuti.
- Controlla i riflessi pizzicando il piede posteriore con una pinza per assicurarti che gli animali siano completamente anestetizzati.
- Applicare una crema per gli occhi sugli occhi per prevenire la disidratazione durante l'anestesia.
- Opzionalmente, misurare lo spessore dell'orecchio di entrambe le orecchie utilizzando un calibro (intervallo 0 - 5 mm). Misura due diverse aree di ciascun orecchio e calcola lo spessore medio dell'orecchio per orecchio.
nota: La misurazione dello spessore dell'orecchio è facoltativa e dipende dalla domanda di ricerca. Tuttavia, se lo spessore dell'orecchio viene utilizzato come lettura per l'infiammazione della pelle, è necessario misurare lo spessore dell'orecchio di base prima dell'infezione. (vedere il passaggio 4).
- Facoltativamente, interrompere la barriera epidermica della pelle dell'orecchio dorsale mediante una leggera rimozione del nastro: applicare manualmente un piccolo pezzo di nastro adesivo sulla pelle e rimuoverlo di nuovo. Ripetere per 5 giri consecutivi utilizzando un nuovo pezzo di nastro adesivo per ogni giro.
NOTA: La Malassezia induce un'infiammazione cutanea più pronunciata nella pelle con barriera integrata rispetto alla pelle non turbata (Figura 2A).
- Applicare localmente 100 μl (2 ODA600) di sospensione di Malassezia/olio d'oliva sul lato dorsale di ciascun orecchio utilizzando una pipetta sterile. Includere un gruppo di controllo di animali trattati solo con olio d'oliva (gruppo di controllo trattato con veicolo).
nota: Agitare energicamente la sospensione di Malassezia/olio d'oliva per garantire una sospensione omogenea di Malassezia immediatamente prima dell'applicazione.
- Lasciare gli animali anestetizzati sul termoforo per evitare l'ipotermia fino a quando non mostrano segni di recupero (movimento dei baffi, aumento della frequenza respiratoria, ecc.).
- Iniettare 200 μL di soluzione sterile e preriscaldata di glucosio al 2% per via sottocutanea nella piega nucale per supportarne il metabolismo e la reidratazione.
nota: Per preparare una soluzione sterile di glucosio al 2%, sciogliere 1 mg di glucosio in 50 mL di PBS e filtrarlo con un filtro da 0,2 μm. La soluzione può essere conservata a 4 °C.
- Trasferisci gli animali nella loro gabbia.
4. Analisi dell'infiammazione cutanea indotta da Malassezia
NOTA: Questa procedura descrive l'analisi del gonfiore dell'orecchio indotto da Malassezia durante l'infezione che funge da parametro dell'infiammazione cutanea. Un prerequisito per l'analisi del gonfiore dell'orecchio indotto da funghi è misurare lo spessore dell'orecchio di base prima della rimozione del nastro e/o dell'infezione (Passaggio 3.5).
- Preparare la camera di isoflurano per l'anestesia a breve termine di animali infetti da Malassezia e di controllo.
- Trasferisci un animale alla volta nella camera e attendi che l'animale sia completamente anestetizzato.
nota: I segni di una corretta anestesia includono il completo rilassamento del corpo e la respirazione lenta e pesante (di fianco). Monitorare attentamente l'anestesia poiché l'esposizione prolungata all'isoflurano può essere fatale.
- Rimuovi l'animale dalla camera e mettilo su un fazzoletto.
- Misurare lo spessore dell'orecchio o degli orecchi utilizzando un calibro (intervallo 0 - 5 mm). Misurare due aree diverse di ciascun orecchio e calcolare lo spessore medio per orecchio (vedere il passaggio 3.5).
- Trasferisci l'animale nella gabbia.
nota: L'anestesia con isoflurano è di breve durata e gli animali si riprendono entro ~ 30 s dopo la rimozione dalla camera dell'isoflurano.
- Calcolare l'aumento dello spessore dell'orecchio sottraendo lo spessore medio dell'orecchio di base, misurato prima della rimozione del nastro e/o dell'infezione, dallo spessore medio dell'orecchio misurato in ogni momento dopo l'infezione.
- Tracciare i valori calcolati come l'aumento dello spessore dell'orecchio o, in alternativa, come lo spessore totale dell'orecchio nel tempo per ogni animale o gruppo di animali (Figura 2B).
5. Analisi della carica fungina nella pelle infetta
- Preparare una provetta sterile da microcentrifuga da 2 mL per ciascun orecchio da prelevare, contenente 0,5 mL di nonidet P40 (NP40) sterile allo 0,05% in dH2O e una sfera d'acciaio autoclavata (diametro 5 mm).
- Pesare i tubi con una bilancia di precisione e annotare il peso preciso.
- Eutanasia dei topi per asfissia da CO2.
- Rimuovere l'orecchio o gli auricolari alla base e trasferirli nella provetta contenente 0,5 mL di NP40 sterile allo 0,05% in dH2O, come descritto nei passaggi 5.1 - 5.2.
- Pesare il tubo contenente il tessuto dell'orecchio e calcolare il peso effettivo di ciascun campione sottraendo il peso del tubo senza l'organo dal peso del tubo con l'organo.
- Omogeneizzare il tessuto dell'orecchio per 6 minuti a 25 Hz utilizzando un omogeneizzatore tissutale. Assicurarsi che il tessuto sia ben omogeneizzato.
- Piastra 100 μl di ciascun campione (corrispondente a 1/5 di ciascun omogeneizzato, fattore di diluizione = 5) su piastre di agar mDixon e incubazione delle piastre capovolte in un incubatore a 30°C.
nota: La quantità di omogeneizzato placcato deve essere regolata in base alla carica fungina prevista. Assicurarsi di disporre di una quantità sufficiente di omogeneizzato per ottenere almeno 10 e non più di 250 colonie per piastra per consentire una facile enumerazione. Facoltativamente, piastra più piastre per campione con diverse diluizioni di omogeneizzato.
- Ispezionare regolarmente la crescita delle colonie di Malassezia.
nota: Le colonie di solito diventano visibili dopo 2 - 3 giorni. Il tempo necessario per la crescita delle colonie di Malassezia dipende dalla specie e dal ceppo di Malassezia.
- Conta le colonie per piastra.
- Calcolare il numero di unità formanti colonie, CFU/g di tessuto utilizzando la seguente formula:
UFC/g tessuto = (numero di colonie/piastra) x (fattore di diluizione) / (peso del campione di pelle in g).
nota: Il limite minimo di rilevabilità approssimativo può essere valutato utilizzando la seguente formula: limite minimo di rilevazione = (1 colonia/piastra) x (fattore di diluizione) / (peso medio di tutti i campioni di pelle in g).
- Le cariche fungine sono solitamente tracciate su una scala logaritmica (Figura 2C).
