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1. Infezione da Mtb di cellule derivate da monociti
NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti in una struttura BSL-3.
- Risospendere il pellet di Mycobacterium tuberculosis (Mtb) in un terreno RPMI privo di siero in una nuova provetta sterile da 50 ml e regolare la concentrazione batterica finale a circa 5 x 106 CFU/mL.
- Rimuovere il terreno di coltura cellulare dalla piastra o dalle piastre a 6 pozzetti contenenti cellule derivate da monociti. Aggiungere 1 mL di terreno RPMI senza siero a ciascun pozzetto. Aggiungere 1 mL di sospensione batterica per pozzetto per ottenere una molteplicità di infezione (MOI) 5:1, cioè 5 x 106 CFU per 106 macrofagi in 2 mL/pozzetto e incubare le piastre per 4 ore a 37°C e 5% di CO2.
- Dopo l'infezione, lavare le cellule 3 volte con 1 ml di tampone di lavaggio sterile per rimuovere i batteri extracellulari. Inclinare la piastra e rimuovere con cautela l'intero tampone di lavaggio dagli angoli. Risospendere le cellule derivate da monociti infettate da Mtb in 2 mL di terreno completo RPMI senza antibiotici e procedere alla colorazione con citometria a flusso o incubare le cellule per altre 24 ore (o altri punti temporali) prima della citometria a flusso.