Un test per studiare il ruolo della vitronectina nell'aderenza batterica alle cellule epiteliali dell'ospite

Abstract

Fonte: Singh, B. et al., Saggi per studiare il ruolo della vitronectina nell'adesione batterica e nella resistenza al siero. J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, dimostriamo un test per studiare il ruolo della vitronectina nell'aderenza di Haemophilus influenzae alle cellule epiteliali dell'ospite.

Protocollo

1. Studio dell'aderenza Vn-dipendente dei batteri alle cellule epiteliali

1. Coltura di cellule A549 (cellule epiteliali alveolari di tipo II) in un pallone di coltura tissutale^da 75 cm 2 con terreno F12 integrato con il 10% (vol/vol) di siero fetale di vitello (FCS) (terreno completo) e 5 μg/mL di gentamicina. Incubare il matraccio in un incubatore con il 5% di CO₂ a 37 °C per 3 giorni fino all'80% di confluente (la confluenza può essere stimata visualizzando la copertura superficiale delle cellule utilizzando un microscopio invertito). I quattro passaggi seguenti descrivono come preparare le cellule epiteliali per il test.
   1. Lavare due volte il monostrato di cellule nel matraccio con 20 mL di PBS agitando delicatamente. Per staccare le cellule dalla superficie del pallone, aggiungere 2 mL di soluzione di enzima per il distacco cellulare e incubare il pallone per 5 minuti a 37 °C. Picchiettare il pallone con il palmo della mano per staccare tutte le cellule dalla superficie di plastica. Pipettare su e giù alcune volte per disperdere i grumi cellulari.
   2. Aggiungere 18 mL di terreno completo F12 al pallone e trasferire l'intera sospensione cellulare in una provetta Falcon sterile da 50 mL. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 200 x g a RT ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno completo F12.
   3. Rimuovere 10 μl della sospensione cellulare e metterla in una provetta Eppendorf, quindi aggiungere 90 μl di soluzione di blu di tripano. Caricare il campione in un emocitometro (profondità 0,1 mm) dopo aver posizionato il vetrino coprioggetti.
   4. Conta tutte le celle vitali nelle aree A, B, C e D (ogni campo è composto da 16 quadrati e ogni quadrato ha un'area di 0,0025 mm²), quindi calcola il numero medio di celle ([A+B+C+D]/4). Calcola il numero di cellule per millilitro usando la seguente equazione:
      Cellule vitali/mL = conta cellulare media × 10⁴ × fattore di diluizione.
      nota: In questo caso, il fattore di diluizione è 10.
   5. Diluire la sospensione cellulare a 5,0 x 10³ cellule/mL utilizzando un terreno completo contenente 5 μg/mL di gentamicina. Erogare 500 μL di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti. Incubare la piastra a 37 °C in CO₂ al 5% fino a quando le cellule sono confluenti al 90%.
2. Prima dell'infezione batterica, rimuovere il terreno dai pozzetti e aggiungere terreno F12 (senza FCS), quindi incubare per una notte a 37 °C.
3. Lavare tre volte il monostrato di cellule con 500 μl di PBS a RT. Porre la piastra sul ghiaccio e aggiungere 100 μl di terreno F12 pre-raffreddato contenente 10 μg/mL di Vn. Incubare la piastra a 4 °C per 1 ora. Per i pozzetti di controllo, aggiungere solo un mezzo F12.
4. Dopo l'incubazione, scartare la soluzione mediante pipettaggio e lavare due volte lo strato cellulare con 1 mL di PBS a RT.
5. Colture Hif isolati clinici in terreno di infusione cervello-cuore (BHI) integrato con 10 μg/mL di NAD ed emina a 37 °C con agitazione a 200 giri/min. Utilizzare il terreno Luria-Bertani per coltivare E. coli. Raccogliere l'Hif a metà della fase logaritmica (OD600 = 0,3) e risospendere i batteri in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,2, contenente l'1% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) (tampone bloccante; PBS-BSA). Regolare la sospensione a 10⁹ CFU/mL. Risospendere una coltura di Hif M10 appena coltivato in terreno F12 (2×10⁸ CFU/mL). Aggiungere 100 μl di questa sospensione batterica a ciascun pozzetto e incubare la piastra per 2 ore a 37 °C.
   nota: Ogni pozzetto contiene circa 2 x 10⁵ celle A549. Per l'infezione, sono state aggiunte 2 x 10⁷ CFU batteriche, corrispondenti a una molteplicità di infezioni di 100.
6. Rimuovere il terreno mediante pipettaggio e lavare le cellule epiteliali A549 tre volte con PBS. Aggiungere 50 μL/pozzetto di soluzione per il distacco cellulare e incubare la piastra per 5 minuti a 37 °C.
7. Quindi, aggiungere 50 μl di terreno completo F12 per pozzetto per arrestare la reazione enzimatica. Trasferire le cellule epiteliali (≈100 μl [cioè l'intero volume]) da ciascun pozzetto in una provetta di vetro da 6 ml contenente quattro perle di vetro. Lizzare le cellule a RT vorticando per 2 minuti.
8. Diluire 100 μl di lisato cellulare aggiungendo 10 μl di lisato a 990 μl di terreno F12. Disporre 10 μl del campione diluito su una piastra di agar per cioccolato.
9. Incubare la piastra di agar al cioccolato a 37 °C per una notte, quindi contare le colonie. Ogni colonia rappresenta un CFU.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta da 5 mL in polistirene a fondo tondo	Falco BD	Codice 60819-138	Stile da 12 × 75 mm
Incubatore fornito al 5% di CO2	Termo Scientifico	BBD6220
Provetta a fondo tondo in polistirene da 6 mL	VWR	89000-478	Modello da 12 × 75 mm con tappo
Piastre a 24 pozzetti	Falco BD	08-772-1H	Grado di coltura cellulare
Pallone per coltura tissutaleda 75 cm 2	Falco BD	BD353136	sfogato
Linea cellulare A549 umana	Sigma-Aldrich	86012804-1VL
Enzima di distacco cellulare (Accutase)	Sigma-Aldrich	A6964-500ML	Grado di coltura cellulare
Albumine sieriche bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	Codice: A2058	Adatto per colture cellulari
F12 medio	Sigma-Aldrich	D6421	Grado di coltura cellulare
Siero fetale di vitello (FCS)	Sigma-Aldrich	Codice: 12003C	Adatto per colture cellulari
Emocitometro	Marienfeld	Codice 640210
Pallone per coltura tissutale	Falco BD	3175167	75 cm2
Vitronectina (Vn) dal plasma umano	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Grado di coltura cellulare