Determinazione del ruolo della vitronectina nella resistenza batterica all'attività battericida del siero umano

Abstract

Fonte: Singh, B. et al., Saggi per studiare il ruolo della vitronectina nell'adesione batterica e nella resistenza al siero.J. Vis. Exp.(2018)

Questo video dimostra il ruolo della vitronectina, una glicoproteina sierica umana, sulla resistenza batterica. Gli anticorpi nel siero interagiscono con le proteine della superficie batterica, attivando le proteine del complemento e formando il complesso di attacco alla membrana, causando la lisi cellulare batterica. Il legame della vitronectina sulla proteina della membrana batterica impedisce la formazione del complesso di attacco alla membrana, con conseguente sopravvivenza batterica.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Analisi della resistenza Vn-dipendente all'attività battericida del siero umano

1. Acquista il normale siero umano (NHS) da una fonte commerciale. Preparare la vitronectina o il siero impoverito di Vn (VDS). Rifornire il VDS con 180 nM Vn che equivale al Vn presente nel NHS.
2. Preparare il siero inattivato termicamente (HIS) riscaldando NHS a 56 °C per 30 minuti al fine di inattivare le proteine del complemento.
   nota: La concentrazione sierica ottimale (5%) e il tempo di incubazione (15 minuti) per il test sono stati determinati empiricamente per Haemophilus influenzae di tipo f (Hif); Questi parametri potrebbero variare per altri agenti patogeni batterici.
3. Coltura di batteri (in questo caso, Hif M10 e il mutante Hif M10Δlph) fino alla fase di log medio (OD₆₀₀ = 0,3). Pellet di batteri mediante centrifugazione a 3.500 x g per 10 min.
4. Risospendere il pellet batterico con 1 volume di tampone Veronal di gelatina di destrosio (DGVB⁺⁺; pH 7,3) contenente il 2,5% (p/v) di glucosio, 2 mM di cloruro di magnesio, MgCl₂, 0,15 mM di cloruro di calcio, CaCl₂ e 0,1% (wt/vol) di gelatina.
5. Aggiungere 1,5 x 10³ unità formanti colonie (CFU) di batteri a 100 μL di DGVB⁺⁺ contenente il 5% di siero (NHS, HIS, VDS o VDS+180 nM Vn). Incubare il campione a 37 °C per 15 minuti con agitazione a 300 giri/min.
6. Prelevare un'aliquota di 10 μl dalla miscela di reazione a 0 min (campione T₀) e 15 min (campione T_t) e impiattare sull'agar di cioccolato. Incubare la piastra a 37 °C per una notte.
7. Dopo l'incubazione, contare le colonie che appaiono sulla piastra. Calcola la percentuale di batteri uccisi utilizzando la seguente equazione: (unità formante colonia o CFU a T_t)/(CFU a T₀) × 100.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta a fondo tondo in polistirene da 6 mL	VWR	89000-478	Modello da 12 × 75 mm con tappo
Siero umano normale (NHS)	Complemento Tecnologia, Inc.	Nhs	Siero umano aggregato
Cloruro di calcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G
glucosio	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
gelatina	Sigma-Aldrich	G9391	Adatto per colture cellulari
Emocitometro	Marienfeld	Codice 640210
Cloruro di magnesio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266-1KG
Vitronectina (Vn) dal plasma umano	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Grado di coltura cellulare
scuotitore	Stuart Scientific	STR6	Agitatore a piattaforma