Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Dissezione e infezione della mucosa cervicale uterina
NOTA: Per risultati ottimali, gli espianti di mucose cervicali dovrebbero essere elaborati e infettati il prima possibile dopo l'intervento chirurgico, idealmente lo stesso giorno dell'intervento. In alternativa, i campioni possono essere conservati immersi in CMT (terreni di coltura integrati con antibiotici) a 4°C per una notte e infettati immediatamente dopo la dissezione.
- Lasciare che il CM raggiunga la RT o metterlo in un bagnomaria preriscaldato a 37°C. Integrare il CM con una soluzione antibiotica (CMT) prima dell'uso. Scartare la soluzione antibiotica avanzata. Versare la soluzione di etanolo al 70% in un contenitore pulito per immergere la pinza e il bisturi ogni volta che è necessario durante la procedura di dissezione. Pulisci gli strumenti e sostituisci la lama del bisturi tra le dissezioni di campioni provenienti da più donatori.
- Utilizzando una pinza sterile, trasferire il campione dal contenitore di trasporto in una piastra di Petri da 100 mm contenente 10-20 ml di CMT.
- Utilizzare il coperchio della capsula di Petri come superficie di taglio per sezionare il tessuto. Tenendo delicatamente il tessuto con una pinza, separare la mucosa dell'ectocervice e/o dell'endocervice dal tessuto stromale e muscolare sottostante (sottomucosa) con un bisturi e una lama per ottenere strisce di mucosa><.
nota: Quando si lavora su un pezzo di tessuto, è importante mantenere il resto del tessuto immerso in un mezzo per evitare l'essiccazione dei tessuti.
- Tagliare la mucosa in strisce larghe 2 mm e rimuovere e scartare quanta più sottomucosa possibile, lasciando solo uno strato di tessuto di 2 mm di spessore. Tagliare le strisce in blocchi di 2 mm di spessore. Ciò dovrebbe comportare espianti di tessuto di circa 8 mm3,
Attenzione: l'uso di strumenti affilati per sezionare campioni umani aumenta il rischio di lesioni e contaminazione. L'operatore dovrebbe prendere in considerazione l'uso di guanti in metallo, rete e antitaglio come protezione aggiuntiva.
- Trasferire gli espianti di tessuto in una nuova piastra di Petri da 100 mm contenente 10-20 mL di CMT per evitare l'essiccazione dei tessuti durante la dissezione. Al termine della dissezione, agitare la piastra per randomizzare la distribuzione dell'espianto.
- Con una pinza sterile, trasferire gli espianti nella/e provetta/e conica sterile da 1,5 mL (massimo 16 espianti per provetta). Rimuovere qualsiasi mezzo nella provetta utilizzando una pipetta.
- Scongelare il preparato HIV-1 a bagnomaria a 37 °C. Se necessario, diluire lo stock virale con CM. Trasferire il virus nella/e provetta/e contenente/e gli espianti. Eliminare qualsiasi preparazione virale residua.
nota: Il materiale virale deve essere diluito in modo che l'inoculo selezionato sia contenuto in un volume di almeno 0,5 ml (Tabella 1). Per ridurre la variabilità dei risultati tra esperimenti indipendenti, la stessa preparazione virale dovrebbe essere utilizzata per un intero studio (Tabella dei materiali).
- Trasferire le provette in un termo-agitatore e incubare per 2 ore a 37°C oscillando a 300 giri/min. Capovolgere delicatamente i tubi un paio di volte ogni 30-60 min.
Nota: per un'infezione efficiente, è fondamentale utilizzare il tempo minimo necessario tra lo scongelamento del preparato per l'HIV-1 e il trasferimento delle provette a 37 °C.
- Riempire una piastra a 6 pozzetti con 3-4 mL per pozzetto di soluzione salina tampone fosfato sterile (PBS). Al termine dell'incubazione con HIV-1, gettare tutto il preparato virale nelle provette in un contenitore con una soluzione disinfettante utilizzando una pipetta. Trasferire gli espianti nella piastra a 6 pozzetti contenente PBS utilizzando una pinza.
- Lasciare riposare gli espianti in PBS per 1 minuto a RT, quindi lavarli pipettando delicatamente su e giù il PBS nel pozzetto 2-3 volte. Gettare il PBS in un contenitore con una soluzione disinfettante utilizzando una pipetta. Aggiungere 3-4 mL di nuovo PBS a ciascun pozzetto. Ripetere altre due volte per un totale di tre lavaggi. Scartare il PBS appena prima di trasferire gli espianti nelle spugne per evitare l'essiccazione dei tessuti.
nota: Gli espianti di mucosa cervicale, e in particolare dell'endocervice, rilasciano grandi quantità di muco durante l'infezione. È fondamentale lavare e rimuovere quanto più muco possibile perché la ritenzione non specifica durante gli espianti e il successivo rilascio del virus nel surnatante di coltura possono mascherare la replicazione del virus.
- Usando una pinza, trasferire 5-8 espianti sopra ogni spugna di gelatina in una piastra a 12 pozzetti. Rimettere la piastra nell'incubatrice.
- Smaltire tutti i rifiuti biologici in contenitori contrapposti secondo le normative dell'istituto sulla gestione di sostanze biologiche pericolose e la valutazione specifica del rischio.
