Quantificazione degli interferoni bioattivi di tipo I utilizzando un saggio reporter di fosfatasi alcalina alcalina embrionale secreta

Abstract

Fonte: Bego, M. G. et al., Valutazione del rilevamento innato delle cellule T CD4⁺ infette da HIV-1 da parte delle cellule dendritiche plasmacitoidi utilizzando un sistema di co-coltura ex vivo. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video mostra il test della fosfatasi alcalina embrionale secreta utilizzando cellule reporter di interferone-α/β HEK-Blue per quantificare gli interferoni di tipo I (IFN) rilasciati in seguito alla stimolazione di cellule dendritiche plasmacitoidi da parte di cellule T CD4⁺ infette da HIV-1.

Protocollo

1. Misurazione dell'IFN bioattivo di tipo I utilizzando cellule reporter HEK-Blue IFN-α/β.

Nota: Queste cellule sono state generate dalla trasfezione stabile di cellule HEK293 con i geni umani STAT2 e IRF9 per ottenere una via di segnalazione IFN di tipo I completamente attiva. Contengono anche il gene reporter della fosfatasi alcalina secreta (SEAP) sotto il controllo del promotore ISG54 inducibile IFN-α/β. La stimolazione di queste cellule con IFN di tipo I attiva la via JAK/STAT/ISGF3 e induce la produzione di SEAP.

1. Mantenere le cellule HEK-Blue IFN-α/β in DMEM integrato con il 10% di FBS. Piastrerli a una densità di 50.000 celle per pozzetto in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, con un volume finale di 180 μl.
2. Miscelare 220 μl di PBMC (diluiti a 850.000 cellule/ml) o 220 μl di cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC) (a una concentrazione compresa tra 100.000 e 500.000 cellule/ml) con 30 μl di cellule T infette (diluite a 10⁶ cellule/ml) per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti con fondo a U.
3. Incubare le co-colture a 37 °C e 5% di CO₂ per 18-22 ore, quindi trasferirle in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V. Centrifugare per 5 min a 400 x g.
4. Aggiungere 20 μl di surnatante di co-coltura a ciascun pozzetto in duplicato. Ogni piastra richiede anche una serie di controlli standard interni (IFNα umano, concentrazione finale da 100 U/ml a 2.500 U/ml). Incubare le piastre a 37 °C e 5% di CO₂ per 18-22 ore.
5. Determinare i livelli di attività della fosfatasi alcalina utilizzando la soluzione QUANTI-Blue, che cambia da rosa a viola/blu in presenza dell'enzima. Preparare QUANTI-Blue seguendo le raccomandazioni del produttore. Aggiungere 180 μl di questa soluzione a ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. A ciascun pozzetto aggiungere anche 20 μl dei surnatanti indotti di cellule HEK-Blue IFN-α/β e incubare la piastra in un incubatore a 37 °C fino a quando il colore non si sviluppa nei pozzetti di controllo standard dell'IFN.
6. Valutare i livelli di SEAP utilizzando uno spettrofotometro a 620-655 nm e determinare la concentrazione di IFN di tipo I mediante estrapolazione dalla parte lineare della curva standard dell'IFN.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Celle MT4	Programma di reagenti NIH AIDS	120	Questo reagente è stato ottenuto attraverso il NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 dal Dr. Douglas Richman.
Celle reporter HEK-Blu IFN-α/β	Invivogen	HKB-IFNAB
Giri di velocità	bisonte europeo	350-000-CL
DMEM	bisonte europeo	319-005-CL
FBS	bisonte europeo	080-150
PHA-L	Sigma-Aldrich	O2769
Kit di isolamento delle cellule T CD4+ II	Myltenyi	Codice 130-091-155
Kit di isolamento di cellule dendritiche plasmacitoidi diamantate II	Myltenyi	130-097-240
QUANTI-Blu	Cedano	REP-QB2
2,5 mg/ml di IgG umane	Sigma-Aldrich	I 4506