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1. Misurazione dell'IFN bioattivo di tipo I utilizzando cellule reporter HEK-Blue IFN-α/β.
Nota: Queste cellule sono state generate dalla trasfezione stabile di cellule HEK293 con i geni umani STAT2 e IRF9 per ottenere una via di segnalazione IFN di tipo I completamente attiva. Contengono anche il gene reporter della fosfatasi alcalina secreta (SEAP) sotto il controllo del promotore ISG54 inducibile IFN-α/β. La stimolazione di queste cellule con IFN di tipo I attiva la via JAK/STAT/ISGF3 e induce la produzione di SEAP.
- Mantenere le cellule HEK-Blue IFN-α/β in DMEM integrato con il 10% di FBS. Piastrerli a una densità di 50.000 celle per pozzetto in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, con un volume finale di 180 μl.
- Miscelare 220 μl di PBMC (diluiti a 850.000 cellule/ml) o 220 μl di cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC) (a una concentrazione compresa tra 100.000 e 500.000 cellule/ml) con 30 μl di cellule T infette (diluite a 106 cellule/ml) per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti con fondo a U.
- Incubare le co-colture a 37 °C e 5% di CO2 per 18-22 ore, quindi trasferirle in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V. Centrifugare per 5 min a 400 x g.
- Aggiungere 20 μl di surnatante di co-coltura a ciascun pozzetto in duplicato. Ogni piastra richiede anche una serie di controlli standard interni (IFNα umano, concentrazione finale da 100 U/ml a 2.500 U/ml). Incubare le piastre a 37 °C e 5% di CO2 per 18-22 ore.
- Determinare i livelli di attività della fosfatasi alcalina utilizzando la soluzione QUANTI-Blue, che cambia da rosa a viola/blu in presenza dell'enzima. Preparare QUANTI-Blue seguendo le raccomandazioni del produttore. Aggiungere 180 μl di questa soluzione a ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. A ciascun pozzetto aggiungere anche 20 μl dei surnatanti indotti di cellule HEK-Blue IFN-α/β e incubare la piastra in un incubatore a 37 °C fino a quando il colore non si sviluppa nei pozzetti di controllo standard dell'IFN.
- Valutare i livelli di SEAP utilizzando uno spettrofotometro a 620-655 nm e determinare la concentrazione di IFN di tipo I mediante estrapolazione dalla parte lineare della curva standard dell'IFN.