Una tecnica per la generazione di particelle simili al virus dell'influenza attraverso un sistema di mammiferi

Abstract

Fonte: Arevalo, M. T., et al.Espressione e purificazione di particelle simili a virus per la vaccinazione. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video dimostra la generazione di particelle simili al virus dell'influenza (VLP) in un sistema di mammiferi. Dopo aver espresso tre vettori di espressione eucariotici, che codificano diverse proteine strutturali virali, in cellule ospiti di mammiferi idonee, le proteine virali espresse si autoassemblano in VLP sulla membrana plasmatica ospite e vengono rilasciate attraverso la gemmazione dalla superficie cellulare.

Protocollo

1. Sistema di espressione dei mammiferi per la generazione di VLP dell'influenza H3N2

1. Subclonare le glicoproteine strutturali virali emoagglutinina (HA), neuraminidasi (NA) e il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) Gag (antigene gruppo-specifico) p55 in vettori di espressione eucariotici, come pTR600 precedentemente descritto.
2. Amplificare il DNA in Escherichia coli chimicamente competente (ad es. DH5α) e isolare il plasmide di grado trasfezione utilizzando un kit di purificazione del plasmide secondo le istruzioni del produttore. La quantità di DNA dipende dalla resa e dalle esigenze dell'utente.
3. Mantenere la linea cellulare di mammifero, 293T, in terreni di crescita contenenti il 10% di siero fetale bovino (FBS) a 37 °C con il 5% di CO₂ in un'incubatrice umidificata.
4. Far crescere le cellule in modo tale che un pallone di coltura tissutale T-150 contenga 45-75 x 10⁶ cellule per pallone in modo tale che il pallone ottenga una completa aderenza cellulare e l'85-95% di confluenza cellulare entro il giorno successivo. Ispezionare le cellule al microscopio per la confluenza desiderata.
   nota: Un'elevata densità cellulare è in genere consigliata per produrre un'espressione proteica ottimale con una citotossicità minima quando si utilizzano reagenti di trasfezione commerciali, tuttavia un'eccessiva confluenza può causare l'accumulo di sottoprodotti di scarto cellulare e ridurre la vitalità cellulare.
5. Il giorno della trasfezione, preparare la miscela di liposomi e DNA secondo le raccomandazioni del produttore e trasfettare le cellule di DNA con una composizione di DNA di 1:1:2 di HA:NA:Gag con una quantità totale di DNA di 40 μg per matraccio T-150. Diluire le soluzioni di DNA e liposomi in terreni di trasfezione privi di siero e senza antibiotici, in modo che ogni pallone contenga un volume totale di 20-30 ml.
   nota: Il rapporto tra i costrutti genici può richiedere l'ottimizzazione da parte dell'utente. Sebbene non sia stato dimostrato qui, una procedura di trasfezione simile è stata eseguita con il virus respiratorio sinciziale (RSV) F e HIV Gag in un rapporto 1:1. Per i plasmidi a singola espressione DENV e CHIKV, viene utilizzato un totale di 20 μg di DNA per fiaschetta di T-150 per un'espressione ottimale. I rapporti DNA:reagenti di trasfezione sono ottimizzati per l'utente. Utilizzare il mezzo di trasfezione raccomandato in base al metodo di trasfezione, ad esempio, le trasfezioni lipidiche policationiche raccomandano la riduzione o l'assenza di siero fetale bovino, quindi i terreni possono essere integrati con ormoni della crescita e oligoelementi per supportare la crescita in assenza di siero.
6. Riportare i palloni a 37 °C con incubatore al 5% di CO₂. Per un volume di 200 ml, utilizzare 9 matracci T-150. Le cellule vengono mantenute in un terreno di coltura di trasfezione fino al giorno della raccolta delle VLP.
7. Raccogliere il surnatante di coltura dalle cellule dopo 72-96 ore dalla trasfezione a seconda dell'antigene, o quando la vitalità cellulare è diminuita al 70-80%, come stimato dall'ispezione microscopica. Trasferire il surnatante in provette coniche da 50 ml e centrifugare le cellule a 500 × g per 5 minuti a 4 °C per pellettare i detriti cellulari.
   Nota: la sostituzione del surnatante di 3 giorni con terreni di trasfezione freschi preriscaldati e privi di siero su cellule aderenti produrrà un secondo lotto di VLP con resa simile o leggermente ridotta e deve essere ottimizzata dall'utente.
8. Raggruppare il surnatante e filtrare attraverso una membrana porosa da 0,22 μm prima della sedimentazione tramite ultracentrifugazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Maxi Kit Plasmidi	Qiagen	Codice: 12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamina	Tecnologie per la vita	L3000075	Lipofectamina 2000, Lipofectamina 3000
Opti-MEM I	Tecnologie per la vita	31985062
Piastra di agitazione multipunto Cimarec I 6	ThermoFisher Scientifico	50094596
Provette per ultracentrifuga Polyclear	Seton	7025
Parte superiore del filtro sottovuoto da 0,22 μm (500 mL)	Nalgene	Codice: 569-0020
glicerolo	sigma	G5516