Generazione di particelle simili al virus Chikungunya utilizzando il sistema di espressione del baculovirus nelle cellule di insetti

1. Espressione di particelle simili al virus Chikungunya (VLP) utilizzando il sistema di cellule di baculovirus/insetti

1. Generare baculovirus ricombinante che esprime il capside del virus chikungunya e le proteine dell'involucro (C-E3-E2-6K-E1) dal ceppo S-27 utilizzando un sistema di espressione di baculovirus commerciale.
2. Coltura di cellule Spodoptera frugiperda Sf9 in terreno di crescita Sf9 privo di siero con 100 U/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina a 28 °C. Utilizzare 3-5 x 10⁵ c/ml per avviare le colture di palloni per la crescita di cellule in sospensione. Passaggio di routine quando raggiungono densità cellulari di 2-4 x 10⁶ c/ml (ogni 3-4 giorni).
3. Colture di cellule Sf9 in sospensione in palloni spinner con agitazione a 130 giri/min su un sistema di piastre di agitazione multipunto. Per una corretta aerazione, mantenere i volumi di coltura a non più della metà del volume del pallone rotante.
4. Per l'espressione di Chikungunya o VLP CHIK, infettare le cellule Sf9 a una densità di 2 x 10⁶ cellule/ml con baculovirus ricombinante a una molteplicità di infezione di 1 e tornare all'incubatore a 28 °C. Tipicamente, infettare una o due fiasche di spinner, contenenti 250 ml di cellule Sf9.
   nota: Sebbene non utilizziamo questo metodo, le cellule Sf9 possono essere coltivate in fiasche di agitazione a 28 °C utilizzando una piattaforma di agitazione.
5. Raccogliere le colture dopo 72-96 ore dall'infezione, o quando la vitalità cellulare è diminuita al 70-80%, come determinato dall'esclusione del blu di tripano secondo il protocollo del produttore.
   nota: Le cellule continuano a proliferare durante l'infezione e vi è una vitalità del ~80% nelle colture Sf9 infettate con baculovirus CHIK VLP ricombinante a 3 giorni dopo l'infezione (dpi). Le cellule infettate da baculovirus hanno un aspetto più grande. La morfologia può anche cambiare da rotonda a oblunga. Nelle fasi avanzate delle infezioni da baculovirus, le cellule hanno iniziato a lisarsi.
6. Trasferire le colture direttamente dalla coltura in sospensione in provette coniche da 50 ml e centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
7. Raccogliere i surnatanti e filtrare attraverso una membrana porosa da 0,22 μm prima della sedimentazione mediante ultracentrifugazione.