Generazione di particelle simili al virus Chikungunya utilizzando il sistema di espressione del baculovirus nelle cellule di insetti

Abstract

Fonte: Arevalo, M. T. et al., Espressione e purificazione di particelle simili a virus per la vaccinazione.J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra come particelle simili a virus, VLP, vengono generate infettando le cellule degli insetti con un baculovirus ricombinante che trasporta la cassetta genetica del virus chikungunya. Il virus ricombinante infetta le cellule, portando alla formazione, all'assemblaggio e al rilascio di VLP nel terreno di coltura per un potenziale utilizzo nella produzione di vaccini.

Protocollo

1. Espressione di particelle simili al virus Chikungunya (VLP) utilizzando il sistema di cellule di baculovirus/insetti

1. Generare baculovirus ricombinante che esprime il capside del virus chikungunya e le proteine dell'involucro (C-E3-E2-6K-E1) dal ceppo S-27 utilizzando un sistema di espressione di baculovirus commerciale.
2. Coltura di cellule Spodoptera frugiperda Sf9 in terreno di crescita Sf9 privo di siero con 100 U/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina a 28 °C. Utilizzare 3-5 x 10⁵ c/ml per avviare le colture di palloni per la crescita di cellule in sospensione. Passaggio di routine quando raggiungono densità cellulari di 2-4 x 10⁶ c/ml (ogni 3-4 giorni).
3. Colture di cellule Sf9 in sospensione in palloni spinner con agitazione a 130 giri/min su un sistema di piastre di agitazione multipunto. Per una corretta aerazione, mantenere i volumi di coltura a non più della metà del volume del pallone rotante.
4. Per l'espressione di Chikungunya o VLP CHIK, infettare le cellule Sf9 a una densità di 2 x 10⁶ cellule/ml con baculovirus ricombinante a una molteplicità di infezione di 1 e tornare all'incubatore a 28 °C. Tipicamente, infettare una o due fiasche di spinner, contenenti 250 ml di cellule Sf9.
   nota: Sebbene non utilizziamo questo metodo, le cellule Sf9 possono essere coltivate in fiasche di agitazione a 28 °C utilizzando una piattaforma di agitazione.
5. Raccogliere le colture dopo 72-96 ore dall'infezione, o quando la vitalità cellulare è diminuita al 70-80%, come determinato dall'esclusione del blu di tripano secondo il protocollo del produttore.
   nota: Le cellule continuano a proliferare durante l'infezione e vi è una vitalità del ~80% nelle colture Sf9 infettate con baculovirus CHIK VLP ricombinante a 3 giorni dopo l'infezione (dpi). Le cellule infettate da baculovirus hanno un aspetto più grande. La morfologia può anche cambiare da rotonda a oblunga. Nelle fasi avanzate delle infezioni da baculovirus, le cellule hanno iniziato a lisarsi.
6. Trasferire le colture direttamente dalla coltura in sospensione in provette coniche da 50 ml e centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
7. Raccogliere i surnatanti e filtrare attraverso una membrana porosa da 0,22 μm prima della sedimentazione mediante ultracentrifugazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Opti-MEM I	Tecnologie per la vita	31985062
Sistema di espressione del baculovirus da bac a bac	Tecnologie per la vita	Codice 10359-016
Parte superiore del filtro sottovuoto da 0,22 μm (500 mL)	Nalgene	Codice: 569-0020
Sf-900 II SFM	ThermoFisher Scientifico	Codice 10902-096
Piastra di agitazione multipunto Cimarec I 6	ThermoFisher Scientifico	50094596