Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Manipolazione degli animali, preparazione e induzione dell'infiammazione
- Utilizzare topi maschi di 4-6 settimane con un peso compreso tra 16 e 20 g. Nota: se i topi sono più vecchi o più pesanti, presentano un eccesso di grasso che circonda il vaso, limitando l'osservazione microscopica.
- Sterilizzare tutti gli strumenti e il tavolo del microscopio prima dell'intervento chirurgico.
- Iniettare 20 mg/kg di LPS (lipopolisaccaride) per via intraperitoneale 4 ore prima della microscopia nel topo vivo per indurre un'infiammazione batterica.
- Preriscaldare una soluzione salina allo 0,9% in un bagno d'acqua a 37 °C per umidificare la camera di plastica e il tessuto mesenterario.
- Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) subito prima della procedura di microscopia. L'anestesia alternativa può essere utilizzata, ad esempio l'inalazione di isoflurano al 2%. Confermare la corretta anestesia mediante la perdita di risposta alla stimolazione riflessa (pizzicare la punta o la coda con una pressione decisa).
- Depilare l'addome utilizzando un rasoio e rimuovere i peli sciolti con una garza imbevuta di etanolo al 70%.
- Applicare un unguento veterinario sugli occhi del topo per prevenire la secchezza, mentre è sotto anestesia.
2. Chirurgia
- Sterilizzare l'addome utilizzando etanolo al 70%. Questo metodo non è sterile e potrebbe essere letale alla fine dell'esperimento.
- Eseguire una laparotomia mediana: aprire la pelle addominale utilizzando una pinza piccola e curva e piccole forbici. Identificare i vasi epigastrici e aprire il peritoneo nella regione della linea alba, per proteggere i vasi.
- Applicare alcune gocce di soluzione salina preriscaldata nella cavità addominale per mantenere umido il tessuto.
- Marcare i leucociti e le piastrine in modo fluorescente iniettando 50 μl di rodamina 6G (1 mg/ml) per via retroorbitale.
- Esteriorizzare un'ansa di ileo e metterla in una capsula di Petri del diametro di 10 cm; assicurarsi di mantenere umido il tessuto applicando la soluzione salina preriscaldata a 37 °C (0,9%) a minuti alterni.
3. Microscopia Intravitale
- Posizionare il mouse sotto il microscopio e portare la vena mesenteraria con un diametro di 200 - 300 μm al centro del campo visivo. Scegli un recipiente senza grasso visibile.
- Non toccare i vasi mesenterari evitando così la stimolazione dell'endotelio. Maneggiare l'ansa dell'ileo con cautela.
- Visualizza le interazioni tra cellule del sangue ed endoteliali con un microscopio invertito o verticale e una fotocamera utilizzando il software del microscopio. Registra le interazioni tra cellule del sangue ed endoteliali per 1 minuto in 4 vene diverse per topo.
- Eutanasia del topo mediante lussazione cervicale dopo il completamento degli esperimenti di imaging.
4. Analisi
- Esegui l'analisi offline e alla cieca per tutti i parametri. Eseguire l'analisi utilizzando qualsiasi programma software adatto.
- Conferma condizioni di flusso sanguigno stabili e comparabili tra loro in cine-clip ad alta risoluzione temporale (frame rate massimo) incentrate sul flusso di cellule ematiche intraluminali.
- Quantifica il numero di leucociti che rotolano. Quindi disegna una linea verticale attraverso la vena e conta tutti i leucociti che attraversano questa linea in 1 minuto.
- Determina la velocità di rotolamento misurando il tempo necessario a un singolo leucocita per superare una distanza di 50 μm mentre rotola stabilmente sull'endotelio. Per fare ciò, disegna due linee verticali a una distanza di 50 μm attraverso la vena.
- Misura il tempo necessario a un leucocita rappresentativo per passare da una linea all'altra. Calcola la velocità dei leucociti dividendo 50 μm per il tempo necessario (μm/s).
- Misurare l'adesione dei leucociti in un campo di 0,04 mm2. Per fare ciò, disegna un quadrato con una lunghezza laterale di 200 μm nella vena.
- Contare i leucociti aderenti sodi, definiti come nessun movimento visibile per 30 secondi, all'interno di questo quadrato.
- Contare il numero di piastrine legate a un leucocita per quantificare le interazioni piastrine-leucociti.
